Glukonik Asit Üretim Yolağı Aktifleştirilmiş ve Endojenik Oksijen Kaynağı Sağlanmış Rekombinant Suşlar Kullanılarak Glukonik Asit Üretimi

Abstract

Endüstrinin en fazla ihtiyaç duyduğu organik asitlerden biri olan glukonik asit (GA) fermantasyon başta olmak üzere birçok proses ile üretilmektedir. Mikroorganizmaların kullanıldığı fermantasyon proseslerinde ortam maliyetini etkileyen en önemli bileşen karbon kaynağıdır. Rekombinant suşların eldesi ve ucuz karbon kaynaklarının kullanımının amaçlandığı bu çalışmada sakkarozu metabolize edebilen E. coli W konakçısı kullanılarak endojenik oksijen kaynağı varlığında ve yokluğunda GA üretimini analiz etmek için alternatif opsiyonlar sunacak şekilde 5 farklı rekombinant suş başarılı bir şekilde hazırlanmıştır. PQQ operonu ve vgb geninin aktarıldığı rekombinant suşlar elde edilmiştir. Elde edilen hemoglobin geni içeren ve içermeyen suşlar ile farklı fermantasyon teknikleri ve ortam bileşimlerinde GA üretim verimleri incelenmiştir. Glikozun karbon kaynağı olarak kullanıldığı fermantasyon prosesinde optimizasyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Glikoz ve CaCO3 konsantrasyonun en etkili olarak belirlendiği deneysel çalışmalar sonucunda glikoza dayalı teorik verimin %92?sine ulaşılmıştır. Melasın kullanıldığı çalışmalarda ise ciddi inhibisyon problemleri ortaya çıkmıştır. Bu sebeple ön işleme tabi tutulmamış melas içeren ortamda mikrobiyal aktivite belirlenememiştir. Proje metninde önerilen ve literatürde olumlu sonuçlar alınan detoksifikasyon yöntemlerinde elde edilen GA değerleri ya çok düşük kalmış ya da hiç elde edilememiştir. GA üretiminde ucuz karbon kaynağının kullanımı önemli bir aşama olduğundan proje çalışmasında sonuç değişkeni olarak GA üretiminin olduğu deneysel tasarımlarla optimizasyon gerçekleştirilmiştir. Burada yapılan deneylerde GA üretimi için ortamda bulunan şekerin glikoz formunda olması ve daha ileri detoksifikasyon işlemlerine ihtiyaç duyulduğu görülmüştür. Şeker pancarı melası ön işlemi aşamasına enzimatik hidroliz basamağı eklenmiş ve GA üretim düzeyinin sülfürik asidin tek başına kullanıldığı ön işlem ile yakın olduğu görülmüştür. Melasın ön işlemi süreci rekombinant E. coli W ile GA üretimi gibi yoğun karbon konsantrasyonu içeren proseslerde hayati önem taşımaktadır. Proje kapsamında klarifikasyon işlemi sonrasında sülfürik asit ön işlemine tabi tutulan melas kullanılarak ortam optimizasyonu deneyleri incelenmiştir. Melasın kullanıldığı ortamda hidroliz sonrası glikozun GA de dönüştürülebildiği früktozun zamanla azalmakla birlikte GA konsantrasyonuna etkisinin olmadığı görülmüştür. Katı substratın kullanıldığı katı hal ve yarı katı hal fermantasyonlarında rekombinant hücrenin katı substratları kullanamadığı, ortamda eklenen ön işlem görmüş melası kullanabildiği belirlenmiştir. Erlenlerde incelenen farklı fermantasyon yöntemlerine kullanılarak GA üretimi çalışmalarında hem vgb geni içeren hem de içermeyen rekombinant hücreler kullanılmış ve elde edile GA konsantrasyonu açısından önemli bir farklılık görülmemiştir. Karıştırmalı ve döner tambur biyoreaktör deneylerinde karbon kaynağı olarak ön işlem görmüş melasın kullanıldığı besiyeri kullanılarak işletme parametreleri optimize edilmiştir. Melasla gelen toplam şeker miktarı göz önüne alındığında 0,57 kg/kg olan verim değerine ulaşılmıştır. Ancak ortamda hidroliz sonrası früktozun kullanılmadığı göz önüne alınınca glikozun tamamın GA dönüştürülebildiği belirlenmiştir. Döner tambur biyoreaktör sisteminde elde edilen GA konsantrasyonları ile karıştırmalı akım biyoreaktör sisteminde elde edilen değer arasında önemli bir farklılık gözlenmemiştir. Rekombinant E. coli W suşu ile optimum besi yeri konsantrasyonları ve reaktör işletme koşulları deneysel çalışma sonucunda ortaya konulmuştur.