FASCİOLA HEPATİCA CATHEPSİN L2 GENİNİN KLONLANMASI VE DNA DİZİLEMESİNİN BELİRLENMESİ

Abstract

Fasciolosis Fasciola hepatica'nın insan ve hayvanlarda neden olduğu paraziter birhastalık olup tüm dünyada ve Türkiye'de sık görülmektedir. Elazığ ve çevresinde isesporadik olgular şeklinde görülmekte olup sağlıklı bireylerde fasciolosis seroprevalansının%2.78 olduğu bildirilmektedir.Fasciolosisin kesin tanısı dışkıda yumurtaların saptanması ile yapılmaktadır. Ancakhastalığın akut döneminde, ektopik yerleşimlerde ve yalancı parazitlik durumlarında bumümkün olmamakta ve serolojik testler kullanılmaktadır.Fasciola hepatica'nın ekskretuvar-sekretuvar antijenlerinin büyük bir bölümünüoluşturan proteazlar F. hepatica'ya özgül olmaları ve antijenik yapıları nedeniyle tanıyöntemlerinde ve korunma amcıyla immünizasyon çalışmalarında kullanılabilecekpotansiyel bir moleküldür. Bu çalışmada F. hepatica cathepsin L2 geninin klonlanması vegen dizilmesinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Bu çalışmada doğal olarak infekte sığır karaciğerinden elde edilen F. hepatica'dantoplam RNA elde edildi ve RNA'dan cathepsin L2 cDNA oluşturuldu. PZR ile çoğaltılancathepsin L2 cDNA pGEM-T Easy vektörüne yerleştirildi. Oluşturulan ve pGEM-T CL2olarak adlandırılan rekombinant vektör kompetan JM109 E. coli hücrelerine transfekteedilerek cathepsin L2 klonlandı. JM109 E. coli kolonilerinden PZR tarama ile elde edilencathepsin L2 cDNA %1.1'lik agaroz jelde yürütülerek gösterildi. Cathepsin L2 cDNA'nınnükleotid dizilemi ve soy ağacı belirlendi.Fasciola hepatica cathepsin L2 Türkiye'de ilk kez klonlanmış olup belirlenennükleotid dizilemi literatürde bildirilen ikinci F. hepatica cathepsin L2 nükleotiddizilemidir. Daha önce Dowd ve ark. tarafından bildirilen F. hepatica cathepsin L2 (genbank no: U62289) ile %99 benzerlik gösterdiği belirlenmiştir.Anahtar kelimeler: F. hepatica, cathepsin L2, klonlama, nükleotid dizilemi, soyağacıFasciolosis is a common parasite disease, caused by Fasciola hepatica thatbeing found throughout all regions of the world including Turkey, affecting bothhuman and animals. Sporadic cases of Fasciolosis have seen in Elazığ and itsseroprevalance in healthy individuals is reported to be 2.78%.Definitive diagnosis of fasciolosis is made by detection of eggs in the hostfaeces. But, detection of eggs is impossible in early infections, ectopic infections andfalse parasitosis, and serologic tests shouls be used to diagnose these conditions.Proteases represents the major parts of the excretory-secretory antigens of theFasciola hepatica and due to their specific antigenic nature they are potential candidatemolecules to be used for diagnosis and immunization methods. The aim of this studywas to clone and determine the sequence of cathepsin L2 gene.In the present study, we composed cathepsin L2 cDNA from RNA that obtainedF. hepatica from liver of naturally infected cattle by reverse transcription polymerasechain reaction (RT-PCR). After PCR amplification, cathepsin L2 cDNA was purifiedand was cloned into the pGEM-T Easy vector. The presence of cathepsin L2 gene wasconfirmed by PCR screening. This recombinant vector that named pGEM-T CL2 wastranfected into JM109 E. coli cells. So, pGEM-T CL2 was obtained from JM109 E. colicells by QIAGEN QIA Prep Kit and the presence of cathepsin L2 gene was confirmedby PCR screening. Cathepsin L2 cDNA was showed by agarose gel electrophoresis. Wedetermined DNA sequencing and performed phylogenetic analysisFor the first time, the cathepsin L2 of F. hepatica cloning was performed andsequencing from a Turkey isolate and nucleotide sequence showed 99% identity withpreviously published sequence of F. hepatica cathepsin L2 (GenBank accession no.U62289) by Dowd et al.Key words: F. hepatica, cathepsin L2, cloning, nucleotide sequencing,phylogenetic tree