Fasciola hepatica cathepsin L1 geninin klonlanması ve rekombinant plazmitlarin polimeraz zincir reaksiyon taraması ile belirlenmesi

Abstract

Bu çalışmada, ülkemizin bir sorunu olan fasiyoloza karşı geliştirmeyi tasarladığınız hızlı serolojik tanı testleri ve DNA aşısı çalışmalarına temel oluşturmak üzere F hepatica Cathepsin L1 protease geninin klonlanması amaçlanmıştır. Doğal olarak infekte sığır karaciğerinin safra yollarından elde edilen yetişkin F. hepatica'lar kullanıldı. TRI reagent kullanılarak toplam RNA elde edildi. Tersine Transkripsiyon ve PZR işlemi için primerler (FhP1 ve FhP2) Genbank EMBL L33771'den yaralanılarak dizayn edildi. Tersine Transkripsiyon ile elde edilen cDNA (F. hepatica'nın Cathepsin L1 geni) PZR ile çoğaltıldı. cDNA, Wizard® Minicolunm (Wizard PCR Preps DNA Purification Systemi) kullanılarak saflaştırıldı ve pTARGET Mammalian Expression Systemi kullanılarak vektöre yerleştirildi. Transformasyon için, E. coli JM109 hücreleri kullanıldı. Hücrelerin istediğimiz rekombinant plazmidi içerip içermediğini tespit etmek için PZR-T işlemi yapıldı. Klonlama işlemi ayrıca enzim kesim deneyi ile de doğrulandı. Bu çalışma, daha özgül serolojik yöntemlerde kullanılabilecek olan Cathepsin L1 proteinlerinin elde edilmesine bir basamak oluşturacaktır. Ayrıca pFhTCL1'in DNA aşısı olarak gelecekte kullanılabilecek olması ayrı bir önem taşımaktadır.