ŞEKER PANCARI MELASINDAN İMMOBİLİZE REKOMBİNANT E.COLİ KO11İLE BİYOETANOL ÜRETİMİNİN ARAŞTIRILMASI

Abstract

Bu çalışmada, karbon kaynağı olarak şeker pancarı melası kullanılarak rekombinant E. coli KO11'den sürekli sistemde biyoetanol üretimi incelenmiştir. Çalışmalar hidroliz, kesikli fermantasyon (serbest ve immobilize hücrelerle) ve sürekli (immobilize hücrelerle) olmak üzere üç aşamada yürütülmüştür. Melas, içeriğinde yaklaşık % 50 sakkaroz bulunun şeker endüstrisinin bir yan ürünüdür. Yapıdaki sakkarozu yapı taşları olan glikoz ve fruktoza dönüştürmek için iki asidik ve bir enzimatik hidroliz yöntemleri uygulanmıştır. Enzimatik hidroliz diğer hidroliz yöntemlerinden daha iyi sonuç vermiştir. Bu nedenle, enzimatik hidroliz şartları Merkezi Kompozit Dizayn (MKD) ile optimize edilmiştir. Hidroliz deneyleri 50 ml çalışma hacmindeki 250 ml'lik erlenlerde, 55 °C ve pH 4.5'da gerçekleştirilmiştir. MKD ile toplamda 20 deney tasarlanmıştır. Optimizasyon çalışmalarında invertaz enzimi kullanılmıştır ve optimum koşullar 87,77 g/L melas konsantrasyonu, 0,45 (%,v/v) enzim konsantrasyonu ve 15,93 saat süre olarak belirlenmiştir. Tez çalışmasının ikinci aşamasında kesikli reaktörde serbest ve immobilize hücreler kullanarak biyoetanol üretim verimi araştırılmıştır. Serbest ortamda 50 ml çalışma hacmindeki 250 ml'lik erlenler kullanılmıştır. 37 °C sıcaklık ve 100 rpm inkübasyon şartlarında yapılan deneyler sonucunda % 96'lık teorik verimle biyoetanol üretilmiştir. Kesikli immobilize mikroorganizmalarla gerçekleştirilen çalışmalar için uygun boncuk yapısını elde etmek amacıyla farklı aljinat ve CaCl2 miktarları denenmiştir. En uygun boncuk VII yapısı % 3 (w/v) aljinat ile % 5 (w/v) CaCl2 çözeltileri kullanılarak elde edilmiştir. Bu boncukların kullanıldığı kesikli fermantasyon deneyinde % 93'lük teorik verime ulaşılmıştır. Çalışmanın son aşamasında kesikli sitemdeki uygun immobilizasyon şartlarında üretilen immobilize E. Coli KO11 suşları kullanılarak sürekli fermantasyon tekniği ile biyoetanol üretimi incelenmiştir. Bu amaçla, kullanılan sürekli sistem kolonu 3 mm kalınlık, 3 cm iç çap ve 20 cm uzunluğuna sahip borosilikat camdan yapılmıştır. Sürekli sistem kolonu dıştan bir ısıtma ceketine sahip olup, deneyler boyunca kolon sirkülasyonlu su banyosu ile 37 °C çalışma sıcaklığında tutulmuştur. Çalışmalarda hidrolizat pH'ları ise E. coli, KO11' in canlılık faaliyetlerini gösterebildiği 6'ya ayarlanmıştır. Farklı seyrelme hızlarının (kolon akış hızı/kolon hacmi) denendiği sürekli fermantasyon deneylerinde ise 1.68 sa-1 seyrelme hızında, % 89 teorik verim elde edilmiştir. Kesikli immobilizasyon ile elde edilen % 93'lük teorik verim ile karşılaştırıldığında, sürekli sistem ile de yüksek oranda biyoetanol üretildiği söylenebilir. Sürekli sistemde maksimum etanol üretildiği sürede kesikli (36 saat) ve sürekli (60 saat) sistemlerin verimliliği karşılaştırıldığında ise, sürekli sistemin açık bir şekilde daha avantajlı olduğu düşünülmektedir. Anahtar kelimeler: Biyoetanol, Şeker Pancarı Melası, E.coli KO11, optimizasyon, İmmobilize Hücre Reaktörü.In this study, bioethanol production from sugar beet molasses as a carbon source has been investigated by using E. coli KO11 in continuous system. The studies have been conducted in three stages: hydrolysis, batch fermentation (with free and immobilized cells), and continuous (with immobilized cells). Sugar beet molasses is a by-product of the sugar industry with about 50 % sucrose in its content. Two acidic and one enzymatic hydrolysis methods were applied to convert glucose and fructose, which are the building blocks of sucrose existing in the structure. It has been determined that enzymatic hydrolysis is better than other hydrolysis methods used. Thus, the enzymatic hydrolysis conditions have been optimized by central composite design (CCD). The hydrolysis experiments have been carried out at 55 °C, in 50 ml working volume of 250 ml flasks, and at pH 4.5. Total 20 experiments have been designed by CCD. İnvertase enzyme has been used in the optimization experiments. The results of enzymatic hydrolysis have been determined as 87.8 g/L molasses concentration, 0.45 (%, v/v) enzyme concentration, and 15.93 h time. The stage of second, yield of bioethanol production have been investigated by using free and immobilization cells in a batch reactor. In free media, working volume of 50 ml has been used flasks with volume of 250 ml. As a results of experiments under conditions carried out incubation at 37 °C and 100 rpm, bioethanol was produced with a theoretical yield of 96 %. To obtain suitable bead structure for studies performed by immobilized microorganisms IX in the batch system, different alginate and CaCl2 quantities were tried. The best available bead structure has been obtained by using solution with alginate concentration of 3 % (w/v) and CaCl2 concentration of 5 % (w/v). Theoretical fermentation yield of 93% was achieved in the batch fermentation experiment using these beads. The final stage of this work, the continuous bioethanol production has been investigated by using immobilized E.coli KO11 strain obtained at the suitable immobilization conditions in the batch system. For this purpose, the continuous system column made of borosilicate glass has 3 mm of thick, 3 cm of inner diameter, and 20 cm of length. The continuous system column has a heating jacket from the outside. The working temperature of the column has been kept at 37 °C during the experiments. The pH of hydrolysates has been adjusted to 6, where E.coli KO11 can show activity. In continuous fermentation experiments, the effect of different dilution rates (column flow rate/column volume) on the bioethanol yield has been examined. 89 % of yield has been obtained from the experiments carried out at dilutin rate of 1.68 h-1. Compared with the theoretical yield of 93 % obtained by batch immobilization experiment results, it can be said that bioethanol is produced at high rate by continuous system. It is thought that the continuous system is clearly advantageous when the productivity of the continuous (36 hours) and continuous (60 hours) systems is compared while the maximum ethanol is produced in the continuous system. Keywords: Bioethanol, Sugar Beet Molasses, E.coli KO11, Optimization, Immobilized Cell Reactor.