İSKEMİK VE UZAK İSKEMİK ARDKOŞULLANMANIN SEREBRAL İSKEMİ REPERFÜZYON HASARINDA APOPTOZ, NEKROPTOZ, PİROPTOZ VE FERROPTOZ ÜZERİNE ETKİLERİ

Abstract

Beynin bir bölgesinde kan dolaşımının kaybı ile karakterize edilen iskemik inme, dünya çapında mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenlerinden biridir. Mekanik trombektomi veya intravenöz tromboliz gibi akut tedavi stratejilerindeki ilerlemelere rağmen, etkili tedavi seçenekleri sınırlıdır. Bu durum araştırmacıları yeni terapötik hedef keşfetmeye yönlendirir. İskemik ardkoşullanma (PostC), uzun süreli iskemiyi takiben reperfüzyon başlangıcında uygulanan bir dizi kısa iskemi/reperfüzyon aralıkları olarak tanımlanır. Uzak iskemik ardkoşullanma (RePostC), iskemiden etkilenen hayati organları, vücudun uzak bölgelerine uygulanan girişimlerle korumayı amaçlayan, non-invaziv bir yaklaşımdır. Hasar sürecinde hücresel homeostaz önemlidir ve sağkalım/ölüm yanlısı süreçler eş zamanlı olarak aktive edilir. Apoptoz, kaspaz bağımlı düzenlenmiş bir hücre ölümüdür. Nekroptoz, nekrotik görünümlü düzenlenmiş bir hücre ölüm türü olarak tanımlanır. Piroptoz, enfeksiyon ve stresle ilişki sinyallere karşı fizyolojik sistemlerin savunmasında kritik öneme sahiptir. Ferroptoz ise demir bağımlı lipid peroksidasyonu ile karakterize hücre ölüm türüdür. Çalışmamızda serebral iskemi/reperfüzyon (I/R) hasarında hücre ölüm yolaklarından apoptoz, nekroptoz, piroptoz ve ferroptozun rolü, mekanik bir tedavi olarak PostC ile RePostC'nin koruyuculukları ve PostC ile RePostC'nin Sestrin2 ve Heksokinaz II düzeyleri üzerine etkileri araştırıldı. Çalışmamızda Spraque Dawley ırkı, 10-12 haftalık 40 adet erkek sıçan kullanıldı. Sıçanlar her grupta 10 hayvan olacak şekilde rastgele 4 gruba ayrıldı. PostC orta serebral arter oklüzyonu sonrası reperfüzyon başlangıcında, 3 siklus 30 sn reperfüzyon/10 sn iskemi şeklinde, RePostC sağ arka bacağa 5'er dk 3 siklus reperfüzyon-iskemi şeklinde uygulandı. Protein ekspresyon düzeyleri Western Blot ve ELISA ile tespit edildi; nekroz alanı için 2,3,5-trifeniltetrazolium klorür (TTC) boyaması ve lökomotor aktiviteyi değerlendirmek için açık alan, dikey çubuk ve kiriş yürüme testleri gerçekleştirildi. Serebral I/R'a bağlı nekroz alan PostC ve RePostC uygulaması ile anlamlı olarak azaldı. Uygulanan tedavi yöntemleri, davranış testlerinde istatistiksel olarak anlamlı bir fark yaratmadı. Apoptotik proteaz aktive edici faktör 1 (Apaf-1), Reseptörle etkileşime giren serin/treonin-protein kinaz 3 (RIPK3), Gasdermin D (GsdmD) ve Sestrin2 (Sesn2) düzeyleri I/R ile anlamlı olarak artarken PostC ve RepostC ile anlamlı olarak azaldı. Uzun zincirli yağ açil-koenzim A sentaz 4 (ACSL4), I/R ile anlamlı olarak artarken RePostC uygulaması ile anlamlı olarak azaldı. PostC uygulaması ile görülen azalma ise istatiksel olarak anlamlı bulunmadı. Heksokinaz II (HK-II) düzeyleri I/R ile anlamlı olarak azalırken PostC ve RePostC ile tedavi edilen gruplarda anlamlı olarak arttı. Serebral I/R hasarının patofizyolojik mekanizmasında apoptoz, nekroptoz, piroptoz ve ferroptoz rol alabilir ve inflamasyon bu mekanizmaya eşlik edebilir. Serebral I/R hasarında PostC ve RePostC apoptoz, nekroptoz, piroptoz ve ferroptozu inhibe ederek antienflamatuvar mekanizmaların aktive olmasına yardımcı olarak koruyucu etki gösterebilir. Apaf-1, RIPK3, GsdmD, ACSL4 ile HK-II ve Sesn2 düzeyleri, serebral I/R hasarının tedavisinde potansiyel terapötik hedefler olarak değerlendirilebilir. PostC ve RePostC uygulaması ile endojen tolerans mekanizmalarını tetiklemek serebral I/R hasarına karşı koruma sağlayabilir.

Ischemic stroke, characterized by the loss of blood circulation in an area of the brain, leads to a range of neurological deficits and is one of the leading causes of death and disability worldwide. Despite advances in acute treatment strategies such as mechanical thrombectomy or intravenous thrombolysis, effective treatment options are limited. This leads researchers to discover new therapeutic targets. Ischemic postconditioning (PostC) is defined as a series of short ischemia-reperfusion intervals applied at the onset of reperfusion following prolonged ischemia. Remote ischemic postconditioning (RePostC) is a noninvasive approach that aims to protect vital organs affected by ischemia by interventions applied to remote areas of the body. Cellular homeostasis is important during the injury process and pro-survival/pro-death processes are activated simultaneously. Apoptosis is a caspase-dependent regulated process. Necroptosis is defined as a regulated type of cell death with a necrotic appearance. Pyroptosis is critical in the defense of physiological systems against infection and stress-related signals. Ferroptosis is a mode of cell death characterised by iron-induced lipid peroxidation. In our study, we investigated the role of apoptosis, necroptosis, pyroptosis and ferroptosis among cell death pathways in cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury, the protective effects of PostC and RePostC as a mechanical treatment and the effects of PostC and RePostC on Sestrin2 levels. This study was performed in 40 male Spraque Dawley rats aged 10-12 weeks. The rats were divided into 4 groups. At the beginning of reperfusion after middle cerebral artery occlusion, 3 cycles of 30 s reperfusion/10 s ischemia were performed as PostC; and 3 cycles of reperfusion-ischemia as RePostC were applied to the right hind leg for 5 min each. Protein expression levels were determined by Western blot; 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for necrosis area and open field, vertical bar and beam walking tests were performed to evaluate locomotor activity. Cerebral I/R-induced necrosis area was significantly decreased with PostC and RePostC administration. The treatment methods applied did not cause a statistically significant difference in behavioural tests. Apoptotic protease activating factor 1 (Apaf-1), receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3 (RIPK3), Gasdermin D (GsdmD) and Sestrin2 (Sesn2) levels were significantly increased by IR and significantly decreased by PostC and RepostC. Long-chain fatty acyl CoA synthase 4 (ACSL4) was significantly increased by I/R and significantly decreased by RePostC treatment. The decrease with PostC treatment was not statistically significant. Hexokinase II (HK-II) level was significantly decreased by I/R, while it was significantly increased in PostC and RePostC treated groups. Apoptosis, necroptosis, pyroptosis and ferroptosis may be involved in the pathophysiological mechanism of cerebral I/R injury and inflammation may accompany this mechanism. In cerebral I/R injury, PostC and RePostC may be protective by inhibiting apoptosis, necroptosis, pyroptosis and ferroptosis and triggering anti-inflammatory mechanisms. Apaf-1, RIPK3, GsdmD and ACSL4 and HK-II, Sesn2 levels may be a potential target for the treatment of cerebral IR injury. Inducing endogenous tolerance mechanisms by PostC and RePostC administration may protect against cerebral I/R injury.