ASPERGİLLUS YÖNÜNDEN POZİTİF OLAN SİNOZAL MUKOZA VE POLİP ÖRNEKLERİNDE MİR-628-3P VE MİR-4455 İFADE SEVİYELERİNİN MOLEKÜLER YÖNTEM İLE ARAŞTIRILMASI

Abstract

Aspergillus türleri, insan sağlığı üzerinde önemli etkiler yaratabilen, küf mantarları sınıfına ait mikroorganizmalardır. Aspergillus türlerinin sinozal mukoza ve polip örneklerinde varlığı, özellikle kronik sinüzit gibi hastalıkların patogenezi ile ilişkilidir. Çalışmada amaç özellikle Aspergillus türlerinin sinüs poliplerinde ve mukoza dokusunda nasıl birikim sağladığını, bu mantarların hastalık gelişimindeki rollerini miR-628-3p ve miR-4455 ifade düzeyleri ile nasıl etkileşimde bulunduğunu moleküler yöntemler kullanarak göstermektir. Çalışmada, T.C. Malatya İnönü Üniversitesi Turgut Özal Tıp Fakültesi Kulak, Burun ve Boğaz Polikliniği'ne başvuran Ekim 2024-Aralık 2024 tarihleri arasında, nazal polip tanısı alan 45 hastanın dokuları değerlendirmeye alındı. Çalışmada örnekler mikolojik ve moleküler testlerde olmak üzere ikiye ayrıldı Örneklerin bir kısmı %10 potasyum hidroksit (KOH) kullanılarak ışık mikroskobu altında incelendi, bir kısmı ise Sabouraud dekstroz agarda (Merk, Darmstadt, Almanya) 14 gün boyunca 30°C'de kültürleri yapıldı. Örneklerin Ekstraksiyon için, üreticinin önerilerine göre bir DNA ekstraksiyon kiti (Invetech, Berlin, Almanya) kullanıldı. Daha sonra Aspergillus pozitif örneklerden miR-4455 ve miR-628-3p seviyelerine bakıldı. Önce Trizol ile RNA izolasyosu yapıldı. RNA izolasyonu sonucunun kalite kontrolü ise 3.5 ?L RedSafe içeren % 1'lik agaroz jelde yürütüldü. Bantlar SYNGENE G-BOX ChemiXRQ UV jel görüntüleme sistemi ile görüntülenip RNA'ların degredasyon durumları kontrol edildi. RNA molekülerinin miktarı ve verimi Qubi?t HS RNA Assay Kit (Katalog No: Q32852, Q32855) kullanılarak Qubit Florometre cihazında ölçümleri yapıldı. Uygun kalitedeki RNA örneklerinden ABScript III RT Master Mix for qPZR (RK20428) ile cDNA sentezi yapıldı. Sentezlenen cDNA örnekleri ile Applied Biosystem Step One Plus Real-Time cihazında PZR reaksiyonu gerçekleştirildi. cDNA sentezi yapıldıktan sonra miR-4455 ve miR-628-3p ifade düzeylerinin belirlenmesi için qRT-PZR reaksiyonu kuruldu. Veriler gruplar arasındaki farklılıkları ortaya koymak için qRT-PZR sonucunda elde edilen sonuçlar DataAssist v3.01 programında analiz edildi. Sonuçta Aspergillus pozitif örneklerde miR-4455'in kontrol grubuna kıyasla daha yüksek ekspresyonu, miR-628-3p'nin daha düşük fold change değeri ile azalışı görülmüştür. Özellikle miR-628-3p'de kontrol ve polip örneklerinin ifade düzeyi miR-4455'e kıyasla daha düşük seviyede olduğu görülmüştür. MiR-4455'in daha fazla artmış ekspresyonu, bu miRNA'nın polip oluşumuna katkıda bulunabileceği ya da inflamatuar süreçlerde önemli bir rol oynayabileceğini göstermektedir. MiR-628-3p, benzer şekilde ekspresyonu ile bu sürece dahil olabilir, ancak etkisi miR-4455'e kıyasla daha sınırlı olabilir.Aspergillus species are microorganisms belonging to the class of mold fungi that can have significant effects on human health. The presence of Aspergillus species in sinonasal mucosa and polyp samples is particularly associated with the pathogenesis of diseases such as chronic sinusitis. The aim of the study was to demonstrate how Aspergillus species accumulate in sinus polyps and mucosal tissue, and how these fungi interact with the expression levels of miR-628-3p and miR-4455 in the development of disease using molecular methods. In this study, tissue samples from 45 patients who were diagnosed with nasal polyps at the Ear, Nose, and Throat Clinic of Turgut Özal Medical Faculty, İnönü University, Malatya, Turkey, between October 2024 and December 2024, were evaluated. The samples in the study were divided into two categories: mycological and molecular tests. Some samples were examined under a light microscope using 10% potassium hydroxide (KOH), while others were cultured on Sabouraud Dextrose Agar (Merk, Darmstadt, Germany) at 30°C for 14 days. For DNA extraction, a DNA extraction kit (Invetech, Berlin, Germany) was used according to the manufacturer's instructions. Afterward, the expression levels of miR-4455 and miR-628-3p were analyzed in Aspergillus-positive samples. RNA isolation was first performed using Trizol. The quality control of the RNA isolation was carried out using a 1% agarose gel containing 3.5 ?L RedSafe, and the bands were visualized with the SYNGENE G-BOX ChemiXRQ UV gel imaging system to check for RNA degradation. The quantity and yield of RNA molecules were measured using the Qubit HS RNA Assay Kit (Catalog No: Q32852, Q32855) and a Qubit Fluorometer. cDNA synthesis was performed from the RNA samples using ABScript III RT Master Mix for qPCR (RK20428). Real-time PCR reactions were carried out with the synthesized cDNA samples on the Applied Biosystem Step One Plus Real-Time device. After cDNA synthesis, qRT-PCR reactions were set up to determine the expression levels of miR-4455 and miR-628-3p. The results obtained from QRT-PCR were analyzed using the DataAssist v3.01 software to identify differences between the groups. As a result, in Aspergillus-positive samples, miR-4455 showed higher expression compared to the control group, while miR-628-3p exhibited a lower fold change with a decrease in expression. Specifically, the expression levels of miR-628-3p in control and polyp samples were found to be lower compared to miR-4455. The increased expression of miR-4455 suggests that this miRNA may contribute to polyp formation or play an important role in inflammatory processes. Similarly, miR-628-3p may be involved in this process with its expression, but its effect may be more limited compared to miR-4455.