Normal meme dokusu ve tümörlerinde pirüvat kinazın saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin karşılaştırılması

Abstract

Bu çalışmada, insan normal ve tümör meme dokusu pirüvat kinazını saflaştırmak, moleküler ağırlığını, kinetik özelliklerini ve inhibitörlerini araştırarak normal meme dokusu ile tümör meme dokusundaki kinetik bulgular yardımıyla biyokimyasal ve histolojik bulgularıkarşılaştırmak amaçlanmıştır. Pirüvat kinaz enzimi insan meme dokusundan kısmi olarak izole edilmiş» yukarıda sözü edilen özellikler araştırılmış ve normal meme dokusu ile tümör meme dokusu karşılaştırılmıştır.Enzim saflaştırılmasında homojenizasyon, amonyum sülfat ile çöktürme, dializ, DEAE sefadeks A-50 iyon değiştirici kromatografi, sefaril S-200 jel filtrasyon, blue sefaroz CL-6B affinite kromatografi işlemleri uygulanmıştır.DEAE sefadeks A-50 kromatografi ile meme dokusunda iki farklı formun varlığı gösterilmiştir. Yani insan meme dokusu pirüvat kinazı iki izoenzim içermektedir. Tümör dokusunda enzim aktivitesi 10.3 kat fazla bulunmuştur. Sefaril S-200 jel filtrasyon ile enzimin moleküler ağırlığı normal meme dokusunda I. pikin 135.000 Da, II. pikin 260.000 Da, tümör dokusunda I. pikin 72.000 Da, II. pikin 250.000 Da olduğu bulunmuştur. SDS-PAGE ile subünitelerinin moleküler ağırlığı normal dokuda I. pikte 30.000 Da, II. pikte 63.000 Da, tümör dokusunda I. pikte 16.500 Da, II. pikte 60.000 Da olarak saptanmıştır. Nativ enzim hemen hemen aynı moleküler ağırlığına sahip subünitelerin birleştirilmesi ile meydana gelen bir tetramerdir.Pirüvat kinaz enzimi normal meme dokusunda L pik 1591 kat, II. pik 636.4 kat, tümör dokusunda I. pik 219 kat, II. pik ise 318 kat saflaştırılabilmiştir.İnsan meme dokusundan izole edilen pirüvat kinaz izoenzimleri diğer doku pirüvat kinaz izoenzimleri ile karşılaştırıldığında bunların Mı ve M2 izoenzim olabileceği düşünülmektedir.