ALPHAHERPESVİRİNAE ALT AİLESİNE MENSUP VİRUSLARDA CRISPR//CAS9 ARACILI EŞ ZAMANLI VİRÜLENS GEN SİLİNMESİ VE HETEROLOG GEN EKLENMESİ

Abstract

CRISPR aracılı hassas gen düzenleme, prokaryotik konakçı-virüs ilişkisi üzerine yapılan araştırmalar neticesinde keşfedilmiş, devrim niteliği taşıyan, önemli bir teknoloji olarak kabul edilmiştir. Biyoloji biliminin birçok alanında olduğu üzere günümüzde viroloji ve antiviral terapide sıklıkla başvurulan, güvenilir ve etkin bir araç haline gelmiş, özellikle viral gen knockout ve knock-in çalışmalarında kullanım alanı bulmasıyla öne çıkmıştır. Bu tez çalışmasında, Alphaherpesvirinae familyasına mensup Bovine alphaherpesvirus 1 (BHV-1) ve Gallid alphaherpesvirus 1 (GaHV-1) model olarak alınmış, bu virüsler için sırasıyla timidin kinaz (tk) ve dUTPaz genleri CRISPR hedef bölgesi olarak seçilmiştir. Sözkonusu bölgelere BHV-1 için bir kırmızı floresan protein geni (rfp) olan DsRed, GaHV-1 için ise DsRed ve Newcastle hastalığı virüsüne ait füzyon (F) geninin insersiyonu hedeflenmiş, bu amaçla insersiyon kasetleri donör plazmid üzerine yerleştirilen tuzak sekansları üzerinden aynı yöntem ile kesilerek serbest bırakılmıştır. Neticede GaHV-1 için DsRed ve F insersiyonu gerçekleştirilmiştir. Ardından Cre-Lox Rekombinasyon metotu kullanılarak reporter geni çıkarılmış, geriye kalan heterolog F gen kasedinin başarılı bir biçimde eksprese olduğu ispatlanmıştır. Ayrıca son ürün rekombinant virüsün, tk defektif ve çift heterolog gen taşıyan virüslere göre plak oluşturma ve zamana bağlı çoğalma kapasitesinde azalmanın olmadığı ortaya konulmuştur. Sonuç olarak çalışmada CRISPR-Cre-Lox metodolojisi birlikte kullanılarak, GaHV-1 üzerinde eşzamanlı gen delesyon ve insersiyon gerçekleştirilmiş, böylelikle virüsün virülens faktörü silinerek attenüe edilirken aynı zamanda heterolog gen (F geni) taşıyan bir multivalan viral vektör elde edilmiştir. Bununla beraber BHV-1'de CRISPR aracılı gen düzenlemenin gerçekleştirilebilmesi için yöntemin geliştirilerek uyarlanacağı yeni çalışmalara ihtiyaç olduğu ortaya çıkmıştır.

CRISPR-mediated precision genome editing is considered as a revolutionary technology, which was discovered as a result of intensive studies on prokaryotic host-bacteriophage interactions. Along with other branches in biology science, CRISPR comes forward a highly efficient, versatile tool frequently implementing in virology and antiviral therapy, especially in gene knock-out and knock-in studies. The main goal of this thesis study was to modify two members of alphaherpesvirinae subfamily, Bovine alphaherpesvirus 1 (BHV-1) and Gallid alphaherpesvirus 1 (GaHV-1). For this purpose, thymidine kinase (tk) and dUTPase genes were targeted for BHV-1 and GaHV-1, respectively. A red fluorescent protein (rfp) gene, DsRed was aimed to insert in tk position of BHV- 1, while DsRed and fusion (F) gene of Newcastle disease virus were chosen for the insertion of GaHV-1. A donor plasmid construction carrying desired gene sequences was excised via CRISPR bait sequences to release linear expression cassettes. As a result, both DsRed and F genes were successfully inserted into desired position of GaHV-1 genome. Next, DsRed reporter gene was erased from the viral genome with using Cre-Lox recombination system, and the F gene expression was proven to remain intact and functional. Finally, obtained recombinant virus possessed insignificant features in the aspects of plaque forming capacity and growth properties than tk deleted and double heterologous gene