SIĞIR VEBASI VİRÜSÜ NÜKLEOPROTEİN GENİNİN KLONLANMASI VE ÖKARYOTİK HÜCRELERDE AÇIKLANMASI

Abstract

l.ÖZET Bu çalışmada, sığır vebası virüsü RBOK aşı suşu (SV-RBOK) nükleoprotein (NP) geninin klonlanması ve ökaryotik hücrelerde açıklatılması amaç edilmiştir. Bu amaçla SV-RBOK ile infekte Vero hücrelerinden elde edilen toplam RNA'lara NP genine spesifik primerlerle tersine transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (TT-PZR) yapıldı. Tersine transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonundan sonra 1575 baz çifti uzunluğunda ürün elde edildi. Sığır vebası RBOK aşı suşu NP geni pGEM-3Zf (-) klonlama vektörüne klonlandı. Nükleoprotein geninin varlığı enzim kesim ve polimeraz zincir reaksiyonu tarama (PZR-T) deneyleri ile teyit edildi. Nükleoprotein genini elde etmek için rekombinant plazmid Nhel ve Sail enzimleri ile kesildi. Daha sonra NP geni pCI- neo memeli açıklama vektörüne yerleştirildi. pCI-neo vektöründe NP geninin varlığını teyit etmek için PZR-T ve enzim kesim deneyleri yapıldı. Sonuçlanan rekombinant plazmid pSV-NP olarak isimlendirildi. pSV-NP geçici olarak Vero hücrelerine transfekte edildi. Vero hücrelerinin 60 kDa'luk NP proteinini açıklaması anti-NP antikorları kullanılarak Vestern immunblotlama deneyi ile gösterildi. Anahtar kelimeler: Sığır vebası virüsü, nükleoprotein geni, klonlama, protein açıklatılması.

In the present study, cloning and expression nucleoprotein (NP) gene of rinderpest virus (RPV) RBOK vaccine strain in eucaryotic cells are reported. For this purpose, total RNA extracted from RPV-RBOK infected Vero cells was subjected to reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) with the NP gene spesific primers. After RT-PCR, a 1575 bp amplicon was yielded. The NP gene of RPV-RBOK vaccine strain was cloned into pGEM-3Zf (-) cloning vector. The presence of the NP gene was confirmed by PCR-screening and enzyme digestion assays. The recombinant plasmid was cut with Nhel and Sail enzymes to obtain the NP gene. Then, the NP gene was placed into pCI-neo mammalian expression vector. To confirm the presence of the NP gene in pCI-neo vector; PCR-screening and enzyme digestion assays were performed. So, the resulting recombinant plasmid was named as pSV-NP. Afterwards, pSV-NP was transiently transfected into Vero cells. The presence of the NP proteins was showed by Western Immunoblotting assay demonstrating that Vero cells express a 60 kDa protein reacting with anti-NP antibody. Key words: Rinderpest virus, nucleoprotein gene, cloning, protein expression.