Fasciola hepatica cathepsin L1 geninin ökaryotik hücrelerde belirlenmesi

Abstract

Fasciola hepatica sıklıkla sığır ve koyunlarda nadiren de insanlarda fasciolosise neden olan bir karaciğer trematodudur. Fasciolosis dünyada ve ülkemizde yaygın olarak bulunmakta ve özellikle hayvancılık sektöründe önemli ekonomik kayıplara yol açmaktadır. F. hepatica'nm ES antijenlerinden olan Cathepsin Ll parazitin dokulara penetrasyonda, immun yanıttan kaçmasında ve beslenmesinde önemli rolü olan bir enzimdir. Özgül antijenik yapısı nedeniyle tanı yöntemlerinde ve korunma amacıyla immünizasyon çalışmalarında kullanılabilecek potansiyel bir moleküldür. Bu çalışmada F. hepatica cathepsin Ll geninin klonlanması ve okaryotik hücrelerde belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla erişkin F. hepatica'dan toplam RNA izolasyonu yapılarak tersine transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (TT-PZR) ile cathepsin Ll DNA amplikonları oluşturuldu. Cathepsin Ll genine özgü primerler kullanılarak 981 bazlık cathepsin Ll geni kodlama bölgesi çoğaltıldı. Daha sonra, cathepsin Ll geni pCI-neo açıklama vektörüne klonlanarak PZR-T ve enzim kesim deneyleri ile genin varlığı doğrulandı. Oluşturulan rekombinant plazmit, pFhCLl olarak adlandırıldı. Rekombinant pFhCLl plazmiti Vero hücrelerine geçici olarak transfekte edilerek cathepsin Ll proteinin varlığı Western immuno blot tekniği ile gösterildi.