AKTİNİK KERATOZ VE SKUAMOZ HÜCRELİ KARSİNOMDA FRAKTALKİNE/CX3CL1 MOLEKÜLÜNÜN İMMÜNREAKTİVİTESİNİN İMMÜNHİSTOKİMYASAL OLARAK İNCELENMESİ

Abstract

Bu çalışmada aktinik keratoz (AK) ve skuamöz hücreli karsinom (SHK) tanısı konmuş hastalardan alınan doku örneklerinden fraktalkin/CX3CL1 molekülünün immünoreaktivitesinin immünohistokimyasal olarak incelenmesi amaçlandı. Tıbbi Patoloji Anabilim Dalı arşivinden 20 adet AK, 20 adet SHK tanısı konmuş deri dokusu örneği ve kontrol grubunu oluşturacak 20 adet hastalıklı doku komşuluğundaki herhangi bir patolojiye rastlanmayan sağlıklı deri dokusu örneği olmak üzere toplam 60 adet doku örneği kullanıldı. Diğer dermatolojik hastalık veya malignite tanısı konmuş ve diabetes mellitusu olan hastaların doku örnekleri çalışmaya alınmadı. Elde edilen deri örneklerinin tanıları doğrulandıktan sonra parafin bloklardan 4-6 µm kalınlığında alınan doku kesitlerine fraktalkin/CX3CL1 için indirekt immünohistokimyasal boyama yapıldı. Parafin bloklardan 4–6 mm kalınlığında alınan kesitler polilizinli lamlara alındı. Deparafinize edilen dokular dereceli alkol serilerinden geçirilip antigen retrieval için sitrat tampon solüsyonunda pH:6'da mikrodalga fırında (750W) 15 dakika kaynatıldı. Kaynatma sonrası oda ısısında yaklaşık 20 dakika soğutmak için bekletilen dokular PBS (Phosphate Buffered Saline, P4417, Sigma-Aldrich, USA) ile 3x5 dakika yıkandıktan sonra endojen peroksidaz aktivitesini önlemek için hidrojen peroksid blok solusyonu ile 5 dakika inkübe edildi (Hydrogen Peroxide Block, TA-125-HP, Lab Vision Corporation, USA). PBS ile 3x5 dakika yıkanana dokulara zemin boyasını engellemek için 5 dakika Ultra V Block (TA-125-UB, Lab Vision Corporation, USA) solüsyonu uygulandıktan sonra 1/200 oranında dilue edilen CX3CL1 primer antikor (CX3CL1 Polyclonal Antibody, bs-0811R, Bioss, USA) ile 60 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildi. Dokular, primer antikor uygulanmasından sonra PBS ile 3x5 dakika yıkandıktan sonra sekonder antikor (biotinylated Goat Anti-Poliyvalent (anti-mouse / rabbit IgG), TP-125-BN, Lab Vision Corporation, USA) ile 30 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildi. Dokular, Sekonder antikor uygulanmasından sonra PBS ile 3x5 dakika yıkanıp Streptavidin Peroxidase (TS-125-HR, Lab Vision Corporation, USA) ile 30 dakika nemli ortamda oda ısısında inkübe edildikten sonra PBS içerisine alındı. Dokulara 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) Substrate + AEC Chromogen (AEC Substrate, TA-015 ve HAS, AEC Chromogen, TA-002-HAC, Lab Vision Corporation, USA) solusyonu damlatılıp ışık mikroskobunda görüntü sinyali alındıktan sonra eş zamanlı olarak PBS ile yıkamaya alındı. Mayer's hematoksilen ile zıt boyaması yapılan dokular PBS ve distile sudan geçirilerek uygun kapatma solusyonu (Large Volume Vision Mount, TA-125-UG, Lab Vision Corporation, USA) ile kapatıldı. Hazırlanan preparatlar Leica DM500 mikroskobunda incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı (Leica DFC295). Boyamada immünoreaktivitenin yaygınlığı (0.1:<%25, 0.4: %26-50, 0.6: %51-75, 0.9: %76-100) ve şiddeti (0: yok, +0.5: çok az, +1:az, +2: orta, +3: şiddetli) esas alınarak histoskor oluşturuldu ve Histoskor= yaygınlık x şiddet formülü kullanıldı. İstatistiksel analiz için SPSS versiyon 22 programı kullanıldı. Gruplar arası değerlendirme One-way ANOVA ve Posthoc Tukey testi ile yapıldı. p?0.05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Fraktalkin/CX3CL1 immünoreaktivitesi kontrol ve AK gruplarında benzer tespit edildi (p=0.931). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında SHK grubunda Fraktalkin immünoreaktivitesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış tespit edildi (p<0.001). Bununla birlikte AK ile karşılaştırıldığında SHK grubunda (p<0.001) fraktalkin/CX3CL1 immünoreaktivitesinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış tespit edildi (p<0.001). Sonuç olarak, bu çalışmada AK ve SHK patogenezine katkıda bulunabileceği düşünülen fraktalkin/CX3CL1 molekülünün sağlıklı bireyler ve AK grubundaki immünoreaktivitesi benzerken SHK grubunda artmış olarak tespit edildi. Bu bulgular fraktalkin molekülünün AK tanısında potansiyel bir biyobelirteç olamayacağını ancak SHK için patogeneze katkı sağlayan muhtemel bir biyobelirteç olabileceğini düşündürmektedir. Fraktalkin molekülünün potansiyel tıbbi öneminin daha iyi anlaşılabilmesi, çelişkili durumların daha iyi aydınlatılabilmesi için gelecekte daha fazla çalışmaya ihtiyaç duyulmaktadır. Anahtar Kelimeler: Aktinik keratoz, skuamöz hücreli karsinom, fraktalkin/CX3CL1

In this study, it was aimed to immunohistochemically investigate the immunoreactivity of the fractalkine/CX3CL1 molecule in tissue samples obtained from patients diagnosed with actinic keratosis (AK) and squamous cell carcinoma (SCC). A total of 60 skin tissue samples were used, consisting of 20 samples diagnosed with AK, 20 samples diagnosed with SCC obtained from the archives of the Department of Medical Pathology, and 20 samples of healthy skin tissue adjacent to diseased areas without any pathological findings, which served as the control group. Tissue samples from patients diagnosed with other dermatological diseases, malignancies, or diabetes mellitus were excluded from the study. After confirming the diagnoses of the obtained skin samples, indirect immunohistochemical staining for fractalkine/CX3CL1 was performed on tissue sections (4–6 µm thick) prepared from paraffin blocks. Sections of 4–6 µm thickness were placed on poly-L-lysine-coated slides. Deparaffinized tissues were passed through graded alcohol series and subjected to antigen retrieval in citrate buffer solution (pH: 6) by boiling in a microwave oven (750 W) for 15 minutes. After cooling at room temperature for approximately 20 minutes, the tissues were washed with phosphate-buffered saline (PBS, P4417, Sigma-Aldrich, USA) for 3×5 minutes. To block endogenous peroxidase activity, the tissues were incubated with hydrogen peroxide blocking solution for 5 minutes (Hydrogen Peroxide Block, TA-125-HP, Lab Vision Corporation, USA). After washing with PBS (3 × 5 minutes), Ultra V Block solution (TA-125-UB, Lab Vision Corporation, USA) was applied for 5 minutes to prevent background staining. The tissues were then incubated with diluted (1:200) CX3CL1 primary antibody (CX3CL1 Polyclonal Antibody, bs-0811R, Bioss, USA) for 60 minutes at room temperature in a humid chamber. Following primary antibody incubation, the tissues were washed with PBS (3×5 minutes) and then incubated with a secondary antibody (biotinylated Goat Anti-Polyvalent (anti-mouse/rabbit IgG), TP-125-BN, Lab Vision Corporation, USA) for 30 minutes at room temperature in a humid chamber. After washing with PBS (3×5 minutes), tissues were incubated with Streptavidin Peroxidase (TS-125-HR, Lab Vision Corporation, USA) for 30 minutes at room temperature in a humid chamber and subsequently placed in PBS. Thereafter, 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) Substrate + AEC Chromogen (AEC Substrate, TA-015-HAS and AEC Chromogen, TA-002-HAC, Lab Vision Corporation, USA) solution was applied, and the staining signal was visualized under a light microscope. The tissues were then washed with PBS. Counterstaining was performed with Mayer's hematoxylin, and the slides were passed through PBS and distilled water before being mounted with an appropriate mounting medium (Large Volume Vision Mount, TA-125-UG, Lab Vision Corporation, USA). Prepared slides were examined and photographed using a Leica DM500 microscope (Leica DFC295). Immunoreactivity scoring (H-score) was calculated based on the prevalence (0.1: <25%, 0.4: 26-50%, 0.6: 51-75%, 0.9: 76-100%) and intensity (0: none, +0.5: very mild, +1: mild, +2: moderate, +3: strong) of staining, using the formula Histoscore = prevalence × intensity. For statistical analysis, SPSS version 22 software was used. Intergroup comparisons were performed using One-way ANOVA followed by the Posthoc Tukey test. A p-value <0.05 was considered statistically significant. Fractalkine/CX3CL1 immunoreactivity was similar in the control and AC groups (p=0.931). A statistically significant increase in fractalkine immunoreactivity was detected in the SCC group compared to the control group (p<0.001). However, a statistically significant increase in fractalkine/CX3CL1 immunoreactivity was detected in the SCC group compared to AC (p<0.001). In conclusion, in this study, the immunoreactivity of the fractalkine/CX3CL1 molecule, which is thought to contribute to the pathogenesis of AC and SCC, was similar in healthy individuals and the AC group, while it was increased in the SCC group. These findings suggest that the fractalkine molecule may not be a potential biomarker in the diagnosis of AC, but may be a possible biomarker contributing to the pathogenesis of SCC. More studies are needed in the future to better understand the potential medical importance of the fractalkine molecule and to better elucidate the contradictory situations. Keywords: Actinic keratosis, squamous cell carcinoma, fractalkine/CX3CL1