HELİCOBACTER PYLORİ CAGA GENİ YÖNÜNDEN POZİTİF OLAN NAZAL MUKOZA VE POLİP ÖRNEKLERİNDE MİR-96-5P VE MİR-5194 İFADE SEVİYELERİNİN MOLEKÜLER YÖNTEM İLE ARAŞTIRILMASI

Abstract

Nazal polipler, nazal ve paranazal boşluklardaki kronik mukozal inflamasyonun bir sonucu olarak ortaya çıkan yarı saydam, yuvarlak, soluk gri renkli kitlelerdir. Nazal polip sebebi olarak düşünülen Helicobacter pylori'nin cagA geni, vücutta şiddetli inflamasyona neden olur. Nazal poliplerde de inflamasyon önemli bir rol oynadığı için, H.pylori enfeksiyonlarının enfeksiyonlarının burundaki inflamasyon süreçlerini etkileyebileceği düşünülmektedir. Bu tez çalışmasındaki amaç; H.pylori cagA nın nazal mukozada ve poliplerdeki varlığını moleküler yöntemlerle incelemek ve bunun yanı sıra, cagA pozitif örneklerde, bu proteinin burun polibi oluşumundaki kritik rolünü belirli miRNA biyobelirteç analizleriyle aydınlatmaktır. Çalışma, H. pylori enfeksiyonlarının etiyolojisini daha iyi anlamak ve yeni tedavi yöntemleri geliştirmek açısından önemli bir adım teşkil etmektedir. Çalışmada, nazal mukoza ve polip örneklerinde PZR yöntemi ile pozitif bulunan H.pylori cagA'nın miR-5194 ve miR-96-5p'in ifade düzeylerine bakılmıştır. Bu amaç için, T.C. Malatya İnönü üniversitesi Turgut Özal Tıp Fakültesi Kulak, Burun ve Boğaz polikliniği'ne başvuran Ekim 2024-Aralık 2024 tarihleri arasında, nazal polip tanısı alan 45 hastanın dokuları değerlendirmeye alındı. Steril şartlarda iki parçaya ayrılan doku örneklerinden bir kısmından, H.pylori ve cagA gen bölgesi pozitifliğini belirlemek için DNA ekstrakrasyonu gerçekleştirilerek PCR yapıldı. Pozitif sonuç veren hastalara ait olan geri kalan polip örneklerinden Trizol ile RNA izolasyonu yapıldı. RNA izolasyonu sonucunun kalite kontrolü ise 3.5 ?L RedSafe içeren % 1'lik agaroz jelde yürütüldü. Bantlar SYNGENE G-BOX ChemiXRQ UV jel görüntüleme sistemi ile görüntülenip RNA'ların degredasyon durumları kontrol edildi. RNA molekülerinin miktarı ve verimi Qubi?t HS RNA Assay Kit (Katalog No: Q32852, Q32855) kullanılarak Qubit Florometre cihazında ölçümleri yapıldı. Uygun kalitedeki RNA örneklerinden ABScript III RT Master Mix for qPZR (RK20428) ile cDNA sentezi yapıldı Sentezlenen cDNA örnekleri ile Applied Biosystem Step One Plus Real-Time cihazında PZR reaksiyonu protokolü uygulandı. Bu şekilde belirlenen genlerin doku örneklerindeki ifade düzeyleri tespit edildi. Real-Time PZR sırasında normalizasyon geni olarak (Housekeeping Gen) U6 kullanıldı. cDNA sentezi yapıldıktan sonra miR-5194 ve miR-96-5p genlerinde mRNA gen ifade düzeylerinin belirlenmesi için qRT-PZR reaksiyonu kuruldu. Reaksiyon karışımı ve termal döngü şartları Genious 2X SYBR Green Fast qPZR Mix (High ROX Premixed) (RK21206) kiti kullanıldı ve üreticinin tavsiye ettiği protokole uygun olarak gerçekleştirildi. Veriler gruplar arasındaki farklılıkları ortaya koymak için QRT-PZR sonucunda elde edilen sonuçlar DataAssist v3.01 programında analiz edildi. Elde edilen H.pylori PZR sonuçları, H.pylori DNA'sı ve cagA gen bölgesinin varlığını nazal poliplerde ortaya koymaktadır. Bu çalışmada, miR-96-5p ve miR-5194'ün ekspresyon seviyelerindeki değişimler incelendi ve miR-96-5p'nin kontrol grubuna kıyasla polip grubunda benzer seviyelerde kaldığı, anlamlı bir değişiklik göstermediği gözlemlendi. Öte yandan, miR-5194'ün polip örneklerinde belirgin bir şekilde arttığı ve polip dokularında daha yüksek seviyelerde ifade edildiği tespit edildi. Anahtar Kelimeler: CagA gen, Helicobacter pylori, miRNA, Moleküler Nazal polipNasal polyps are semi-transparent, round, pale gray masses that arise as a result of chronic mucosal inflammation in the nasal and paranasal cavities. Helicobacter pylori, thought to be a cause of nasal polyps, carries the cagA gene, which induces severe inflammation in the body. Since inflammation plays a significant role in nasal polyps, it is believed that H.pylori infections may influence the inflammatory processes in the nasal area. The aim of this thesis is to investigate the presence of H.pylori cagA in nasal mucosa and polyps using molecular methods, and to clarify the critical role of this protein in the formation of nasal polyps in cagA-positive samples through specific miRNA biomarker analyses. This study is an important step in understanding the etiology of H.pylori infections and developing new treatment methods. In this study, the expression levels of miR-5194 and miR-96-5p were examined in nasal mucosa and polyp samples where H.pylori cagA was found positive by PCR method. For this purpose, tissue samples from 45 patients diagnosed with nasal polyps at the Ear, Nose, and Throat clinic of Turgut Özal Medical Faculty, İnönü University, Malatya, Turkey, between October 2024 and December 2024, were evaluated. One part of the tissue samples, divided into two under sterile conditions, was used for DNA extraction to determine the presence of H.pylori and cagA gene regions through PCR. RNA isolation was then performed on the remaining polyp samples from patients who showed positive results using Trizol. Quality control of RNA isolation was carried out on a 1% agarose gel containing 3.5 ?L of RedSafe. Bands were visualized using the SYNGENE G-BOX ChemiXRQ UV gel documentation system, and the degradation status of the RNAs was checked. The quantity and yield of RNA molecules were measured using the Qubit HS RNA Assay Kit (Catalog No: Q32852, Q32855) with the Qubit Fluorometer device. cDNA synthesis was performed using ABScript III RT Master Mix for qPCR (RK20428) on RNA samples of appropriate quality. The cDNA samples were then subjected to PCR reactions in the Applied Biosystems Step One Plus Real-Time system. The expression levels of the genes in the tissue samples were determined. U6 was used as the housekeeping gene for normalization during Real-Time PCR. After cDNA synthesis, a qRT-PCR reaction was set up to determine the mRNA gene expression levels of miR-5194 and miR-96-5p. The reaction mixture and thermal cycling conditions were performed according to the manufacturer's protocol using the Genious 2X SYBR Green Fast qPCR Mix (High ROX Premixed) (RK21206). The results of the qRT-PCR were analyzed using the DataAssist v3.01 program to reveal differences between groups. The H.pylori PCR results obtained revealed the presence of H.pylori DNA and cagA gene regions in nasal polyps. In this study, changes in the expression levels of miR-96-5p and miR-5194 were investigated. It was observed that miR-96-5p remained at similar levels in the polyp group compared to the control group, showing no significant change. On the other hand, miR-5194 was found to be significantly elevated in the polyp samples and expressed at higher levels in polyp tissues Keywords: CagA gene, Helicobacter pylori, miRNA, Molecular, Nasal polyp