Bilgisayar destekli sperma analizi sırasında spermanın hazırlanmasındaki bazı farklılıkların ve sistemik ayar değişikliklerinin dondurulmuş boğa, aygır ve koç spermasının çözdürme sonrası sperm motilitesi ve kinematik parametrelerine etkisi

Abstract

Bu çalışmanın temel amacı, dondurulup çözülmüş boğa, koç ve aygır spermalarında, spermanın hazırlanması sırasındaki çeşitli uygulamaların ve bazı sistemik ayar değişikliklerinin CASA analizi ile belirlenen hareketlilik ve kinematik parametreler üzerindeki etkilerini araştırmaktır. Bununla birlikte, saha koşullarında suni tohumlama için nitelikli dondurulmuş koç spermasının üretimi ve satışının oldukça sınırlı olması yüzünden çalışmanın ilk bölümünde, farklı sulandırıcıların, gliserolizasyon süresindeki değişimin ve farklı dondurma hızlarının koç spermasının başarılı bir şekilde dondurulması üzerindeki etkileri bireysel farklılıklara göre incelendi. Bu amaçla, 8 adet koçtan suni vajen yöntemiyle sperma alındı. Her bir sperma örneği dört farklı sperma sulandırıcısı (TrisA, TrisB, OptiXcell INRAFreeze) ile sulandırıldı. Soğutma işleminin ardından tüm gruplardaki sperma örnekleri 0,25 ml'lik payetlere çekilerek otomatik dondurma kabininde hem kısa süreli dondurma hem de uzun süreli dondurma yöntemine göre donduruldu. Sonraki aşamada ise, toplam 17 koçtan alınan sperma örnekleri ilk bölümünden elde edilen en iyi sonuçlara göre dondurulup koçlar arasındaki bireysel farklılıklar incelendi. Bu aşamanın sonunda belirlenen kalite kriterlerini karşılayan koçlardan alınan dondurulmuş sperma örnekleri deneyin sonraki aşamasında kullanıldı. Çalışmanın ikinci aşamasında, sperma örneklerinin seyreltilmesinde kullanılan sulandırıcı solüsyonların, numune miktarının ve sperma örneklerinin çözdürülme ve seyreltilme sonrası bekletilme sürelerinin dondurulmuş boğa, aygır ve koç spermalarında CASA sistemi ile belirlenen çözdürme sonrası hareketlilik ve kinematik parametreler üzerine etkileri araştırıldı. Ayrıca, bu çalışmada tüm türlerde VCL, VAP ve STR eşik değerleri gibi bazı CASA sistemik ayar değişikliklerinin ve muayeneler sırasında görüntü sayısındaki değişikliklerin hareketlilik ve kinematik parametreler üzerindeki etkileri incelendi. Bu bölümdeki tüm aşamalarda her türden 6 farklı hayvanın 8 payeti olmak üzere toplam 48 donduruluş sperma örneği kullanıldı. Dondurulmuş sperma örneklerinde çözdürme sonrası bir eppendorf tüpüne aktarılarak uygun sıcaklıkta korundu. Ardından her gruptaki sperma örneklerinin çözdürme sonrası hareketlilik ve kinematik parametre değerleri CASA analiz sistemi aracılığıyla belirlendi. Sunulan çalışmamızda, gliserolün kademeli olarak ilave edildiği Tris-yumurta sarısı sulandırıcısı ile uzun süreli dondurma yöntemi kullanılarak dondurulan koç spermalarının diğer gruplara göre daha yüksek motilite oranı gösterdiği belirlendi. Bununla birlikte, uygulanan yöntemin koçlar arasında bireysel olarak önemli düzeyde değişkenlik gösterdiği tespit edildi. Dondurulmuş boğa ve koç spermalarının çözdürme sonrası yapılan CASA muayenelerinde OPTX sulandırıcısının, dondurulmuş aygır spermalarının muayenesinde ise INRA hazır sulandırıcısının bir seyreltme solüsyonu olarak kullanılabileceği belirlendi. Diğer taraftan, mevcut çalışma, sperma örneklerine hem çözdürme hem de seyreltme işleminden sonra dört dakikalık bir bekletme süresi uygulanmasının CASA analiz sonuçlarının güvenilirliği için önemli olduğunu gösterdi. Ancak özellikle aygırlarda bu sürenin uzaması belirlenen CASA analiz sonuçlarını olumsuz yönde etkiledi. Muayene öncesinde sulandırma oranı değiştirilmeden 15 µL ile 60 µL arasında numune miktarı kullanılmasının yapılan analiz sonuçlarını etkilemediği belirlendi. Buna ilaveten, farklı türlerin dondurulmuş spermalarının çözdürme sonrası CASA sistemiyle yapılan muayenelerinde 3 ile 6 arasında bir görüntü alanı seçilmesinin yeterli olduğu gözlendi. Çalışmamızda VAP eşik değerlerindeki değişikliklerin dondurulmuş aygır spermasında çözdürme sonrası progresif motiliteyi önemli derecede etkilediği gözlenirken, boğa ve koç spermalarında oluşan farklılıklar istatistiksel olarak önemli bulunmadı. Diğer taraftan, STR eşik değerlerindeki değişikliklerin dondurulmuş aygır spermasında çözdürme sonrası progresif motiliteyi önemli ölçüde etkilemediği, ancak dondurulmuş boğa ve koç spermasında önemli derecede değişkenliğe yol açtığı gözlendi. Sonuç olarak, farklı türlere ait dondurulmuş-çözdürülmüş spermalarda CASA analizi ile belirlenen motilite ve kinematik parametreleri üzerinde seyreltici olarak kullanılan sulandırıcı içeriğinin, muayene öncesi bekletme sürelerinin ve VAP ve STR referans eşik değerlerinin önemli bir etkiye sahip olduğu görülmektedir. Bu nedenle, CASA analizlerinde elde edilen verilerin doğru ve kabul edilebilir olması için bu faktörlerin bilimsel çalışmalarda açıkça ortaya konulması ve tür özelliklerine göre standardize edilmesi zorunludur. Anahtar Kelimeler: Motilite, CASA ayarları, VAP, STR, StandardizasyonThe primary objective of this study was to investigate the effects of various applications in semen preparation and some systemic setting changes on motility and kinematic parameters determined by CASA analysis in frozen-thawed bull, ram and stallion semen. However, due to the limited the production and sale of frozen ram semen for artificial insemination under field conditions, the initial section of the study examined the effects of different extenders, alterations in glycerolization time, and different freezing rates on the successful freezing of ram semen based on individual differences. For this purpose, semen was collected from eight rams utulising the artificial vagina method. Each semen samples were individually diluted with four different sperm extenders (TrisA, TrisB, and OptiXcell INRAFreeze). Following a period of cooling, semen samples from all groups were drawn into 0.25 ml straws and frozen in an automated freezing cabinet using both the short-term and long-term methods. In the subsequent stage, semen samples were collected a total of 17 rams were frozen using the most optimal method identified in the initial stage, and individual differences between rams were examined. The frozen semen samples from rams that satisfied the quality criteria established at the conclusion of this stage were utilised in the subsequent stage of the experiment. In the second phase of the study, the effects of the extender solutions used for dilution, the sample size, and the post-thawing and post-dilution holding times of the semen samples prior to examination on post-thawing motility and kinematic parameters determined by the CASA system in frozen bull, stallion and ram semen were investigated. Furthermore, the present study investigated the effects of some CASA systemic setting changes as the the cut-off values of VCL, VAP and STR and the effects of changes in the number of images during examinations on motility and kinematic parameter in all species. A total of 48 frozen semen samples were utilised throughout all stages of this section, comprising eight straws from six different animals of each species. Following thawing, the semen samples were transferred to an Eppendorf tube and stored at the appropriate temperature. The post-thawing motility and kinematic parameter values of the semen samples from each group were subsequently determined using the CASA analysis system. The present study determined that the post-thaw progressive motility of ram semen frozen using the long-term freezing method with a Tris-egg yolk extender, with gradual addition of glycerol, was higher than that of the other groups. However, the method employed revealed significant individual variability among the rams. It was determined that the OPTX extender could be used as a dilution solution in CASA examinations of frozen bull and ram semen after thawing, and that the INRA extender could be used as a dilution solution in the examination of frozen stallion semen. Furthermore, the present study has demonstrated that a holding time of four minutes for semen samples both after dilution and after thawing was essential for the reliability of CASA analysis results. However, the prolongation of this period, especially in stallions, had a negative impact on the CASA analysis results. it was determined that utilising a sample volume ranging from 15 µL and 60 µL, without altering the dilution ratio prior to the examination, did not affect the analysis results. Furthermore, it was observed that selecting an image area between 3 and 6 was sufficient during the examinations. Furthermore, the significant alterations in the cut-off values of VAP were observed to exert a substantial influence on post-thaw progressive motility in frozen stallion semen. However, no statistically significant differences were detected on bull and ram semen. In contrast, alterations in the cut-off values of STR were found not to have a significant effect on post-thaw progressive motility in frozen stallion semen; however, they did result in significant variability in frozen bull and ram semen. In conclusion, it appears that the extender content used as the diluent, pre-examination holding times and reference cut-off values of VAP and STR have a significant impact on motility and kinematic parameters determined by CASA analysis in frozen-thawed semen from different species. It is therefore important that these factors are clearly presented in scientific studies and standardised according to species characteristics in order for the data obtained in CASA analyses to be accurate and acceptable. Key Words: Motility, CASA settings, VAP, STR, Standarditation