HEPATİT B VİRÜSÜ HBCAG GENİNİN KLONLANMASI VE ÖKARYOTİK HÜCRELERDE AÇIKLANMASI

Abstract

Bu çalışmada, hepatit B virüsünün kor antijeni (HBcAg) geninin Escherichia coli (E. coli)' de klonlanması ve HBcAg proteinin ökaryotik hücrelerde açıklatılması rapor edilmiştir. Çalışmada, öncelikle, HBcAg geni, hepatit B virüsle infekte hasta serumundan izole edilen DNA' dan polimeraz zincir tepkimesiyle (PCR) çoğaltıldı ve pUC19 plazmitine yerleştirildi, Elde edilen rekombinant plazmit (pHBc-1) E. coli hücrelerinin transformasyonunda kullanıldı. pHBc-1 plazmiti içindeki HBcAg gerıinin varlığı PCR ve enzim sindirme deneyleri ile doğrulandı. Daha sonra, rekombinant plazmit klonlanndan EcoKL ve Hindül restriksiyon enzimleriyle uzaklaştınlan HBcAg geni, ökaryotik eksprasyon plazmiti olan, pcDNA3 içine yerleştirildi. Oluşturulan rekombinant plazmit, pcDNA-HBc, içindeki HBcAg geninin varlığı yine restriksiyon enzim sindirimi deneyi ile test edildi. Daha sonra, pcDNA-HBc, ökaryotik Vero hücrelerine transfekte edildi ve pcDNA-HBc plazmitini istikrarlı bir şekilde taşıyan hücre hatları, Vero-HBc, genetisin içeren kültür vasatında seçildi. Vero-HBc hücrelerinde HBcAg proteinin açıklanması Western Immunoblot deneyi ile test edildi. Immunoblotlamada Vero-HBc hücrelerinde 21 kilodalton (kDa) büyüklüğünde HBcAg proteini belirlendi. Sonuç olarak, bu çalışmada günümüzün en ciddi sağlık sorunlarından birini oluşturan hepatit B virüsün kor antijenini şifreleyen gen klonlanarak ökaryotik hücrelerde açıklatılmıştır. Bir viral proteini şifreleyen genin izolasyonundan eksprâsyöriunâ kadar olan aşamaları içeren çalışma, bu alanda ülkemizdeki ilklerden birini temsil etmektedir.

In the present study, cloning of (HBcAg) gene in Escherichia coli and expression of the gene in eukaryotic cells are reported. Hepatitis B virus (HBV) core antigen gene was amplified from the sera of HBV infected patients in a polymerase chain reaction (PCR) and placed into pUC19 plasmid. The resulting recombinant plasmid, termed pHBc-1, was used in transformation of E. coli cells. The presence of HBcAg in pHBc-1, was confirmed by both PCR and restriction enzyme digestion, which has only single restriction site in HBcAg coding sequence. Later, HBcAg gene was excised from pHBc-1 and inserted into a eukaryotic expression vector pcDNA3. Again, the placement of HBcAg gene in the resulting plasmid pcDNA-HBc was tested with restriction enzyme digestion. For this purpose, EcoR I and HindUl enzymes which were also utilized in the insertion of the gene into the plasmid in the first place, were used. Afterwards, pcDNA-HBc was transfected into Vero cells. Cells stably transfected with pcDNA-HBc plasmid (Vero-HBc) were seleceted in geneticin containing culture medium. The presence of HBcAg gene in Vero-HBc cells were again confirmed with PCR assay. Additionally, the expression of HBcAg gene by Vero-HBc cells were tested in Western Immunoblotting assay. The result of immunoblotting assay demonstrated that, Vero-HBc cells indeed express a 21 kDa protein reacting with anti-HBcAg antibody. In conclusion, in the present study, it was shown that HBcAg gene of hepatitis B virus, one of the most serious health hazards of modern day world, was cloned in E.coli and expressed in Vero cells. The expressed HBcAg seems to have authentic antigenic properties as determined by Western Immunoblotting assay.