PRENATAL DÖNEMDE TRANSFORMİNG GROWTH FAKTÖR-BETA (TGF-BETA)'YA YÜKSEK DOZ A VİTAMİNİNİN ETKİLERİNİN İMMÜNOHİSTOKİMYASAL OLARAK BELİRLENMESİ

Abstract

Transforming growth faktör p (TGF-p1) izoformları hücresel büyüme ve farklılaşmayı, ekstraselüler matriksin sentezlenmesini ve immüniteyi düzenleyen polipeptidlerdir. Benzer şekilde, retinoidler proliferasyon, farklılaşma, görme, üreme ve embriyonik gelişim gibi bir çok fizyolojik olayda önemli rol oynamaktadırlar. Bu çalışmanın amacı farklı iki gelişim periyodunda yüksek doz retinoik asitin embriyonik gelişim üzerine ve beyin ve kalp dokularında TGF- (32'nin immünohistokimyasal olarak işaretlenmesi üzerine etkilerinin araştırılmasıdır. Çalışmada 52 adet Wistar cinsi dişi sıçan kullanıldı. Ratlara her sabah vajinal smear yapıldı. Proöstrusta olduğu belirlenen dişiler aynı günün akşamı erkek ratlar ile 1:1 eşlendi. Ertesi sabah yapılan vajinal smearde sperm (+) olan sıçanlar gebeliğin 0. gününde sayıldı. Deney grubu gebe sıçanlara gebeliklerinin 8. ve 12. günlerinde tek doz zeytin yağında eritilen 60 mg/kg dozda all-trans retinoic acid oral yoldan verildi. Kontrol grubu sıçanlara sadece zeytin yağı verildi. Kontrol grubu ve deney grubu sıçanlar gebeliklerinin belli günlerinde servikal dislokasyon ile öldürüldü. Uteruslan açılan sıçanların implantasyon ve rezorpsiyon bölgeleri sayıldı. Fötuslann ağırlıkları tartıldı, tepe-kuyruk uzunlukları ölçüldü. Veriler istatistiksel olarak değerlendirildi. All-trans retinoik asitin etkisiyle oluşan yapısal bozukluklar incelendi. Embriyolar ışık mikroskobik takip serilerinden geçirilip parafin bloklar hazırlandı. Kalp ve beyin dokusundan alınan kesitlere avidin-biotin-peroksidaz yöntemi ile TGF-|32 immünohistokimyasal boyama yapıldı. Gebeliğin erken dönemlerinde uygulanan all-trans retinoik asitin ekzensefali, eksoftalmus, abdominal duvar defektleri ekstremitelerde kısalık gibi gelişim bozukluklarına yol açtığı görüldü. Yapılan immünohistokimyasal çalışma sonucunda TGF-J32 immün reaksiyonunun gebelik gününe ve prenatal 8. günde uygulanan all-trans retinoik asitin etkisine bağlı olarak değişiklik gösterdiği tespit edildi. Gebeliğin 8. gününde uygulanan retinoik asitin 15. günde beyin dokusunda immün reaksiyonda azalmaya, 18. günde ise artışa yol açtığı görüldü. Gebeliğin 12. gününde TOKÜMANT4SYON MEBMİZİuygulanan retinoik asitin beyin dokusunda TGF-J32 işaretlenmesinde belirgin bir değişiklik oluşturmadığı ve kontrol grubu ile benzerlik gösterdiği tespit edildi. Kalp dokusundaki immün reaktivite gebeliğin 20. günü dışındaki gruplarda endokardial ve perikardial tabakalarla sınırlı idi. Prenatal 20 günlük fötal kalplerde miyokardial hücrelerde de immün reaksiyon gözlendi. Fakat uygulanan yüksek doz retinoik asitin kalp dokusundaki TGF-|32 işaretlenmesinde azalmaya yol açtığı görüldü. Sonuç olarak, gebeliğin erken periyodlarında uygulanan all-trans retinoik asitin şiddetli malformasyonlara yol açtığı saptandı. TGF-|32'nin beyin ve kalp dokularındaki işaretlenmesinin, gebelik gününe ve erken gelişim periyodunda uygulanan yüksek doz all-trans retinoik asitin etkisine bağlı olarak değişiklik gösterdiği gözlendi.Type P transforming growth factors (TGF- j3) are a family of polypeptides that regulate cell growth and differentiation, extracellular matrix formation and immun function. Similarly, retinoids are important for multiple physiological proceses such as cell proliferation and differentiation, vision, fertility and embryonic development. The aim of this study was to investigate teratojenic effect of high dose retinoic acid on two different gestational period and interaction between retinoic acid and TGF- |3 during embryonic development. Fifty two adult Wistar female rats used in this study. For mating, female rats were controlled with vaginal smear every morning and was after determination of proeustrus cycle the females were paired 1:1 with male rats. At the next day morning, following the mating procedure was designated gestation day (GD) 0 if sperm was detected in the vaginal smear. Pregnant rats were gavage fed single dose 60 mg/kg body weigth of all-trans retinoic acid (atRA) suspended in olive oil on 8 day or 12 day of gestation. Control animals were given comparable volume of olive oil. Control pregnant rats and pregnant rats retinoic acid administered were killed with cervical dislocation during certain gestational days. Their uteri were removed and the number of implantation and resorption site were recorded. Conceptus were removed from the uterus and weighed and examined for external gross malformations. Then fixed with Bouin's solution and crown-rump length was measured. Data were statistically analysed. Embryos were embeded in paraffin wax and the distribution of TGF- P2 protein in heart and brain tissue was evaluated by irnmunohistochemical staining using the avidin- biotin-peroxidase method.Many malformations including exencephali, exophtalmus, abdominal wall defect, extremity reduction defect, were observed in this experimental study depend on exposured the all-trans retinoic acid at early development period. Using immunohistochemical methods, we determined the expression of TGF- P2 and the effects of retinoic acid on TGF- (52 expression. It was observed that expression of TGF- 132 varies depend on gestation day and effects of retinoic acid. It was observed in this study that fetal brain had immun reaction with TGF- p2. Depend on all-trans retinoic acid, expression of TGF- P2 reduced at gestation day 15, however expression of TGF- J32 was remarkably increased at gestation day 18 by all-trans retinoic acid which was administred at gestation day 8. Retinoic acid, which was administred on gestation day 12, did not have any significant effect on TGF- p2 expression. Fetal brain of these groups immun staining resembled with control groups. TGF- p2 staining in heart tissue particularly restricted with endocardial and pericardial layer except from on gestation day 20. In fetal heart tissue belong to prenatal 20-day fetus showed immune reaction in the miyocardial cells too. But excess retinoic acid lead to decreasing of immune reaction in the heart tissue. As a result, all-trans retinoic acid lead to severe congenital malformtion at early gestational day. Immunohistochemical expression of TGF- (32 was changed depending upon gestation day and effects of all-trans retinoic acid in brain and heart tissues.