Echinococcus granulosus sensu stricto’nun G1 ve G3 Genotiplerinin Ayrımında PZR-RFLP ve SSCP Metotlarının Eş Zamanlı Kullanımı

Abstract

Kistik ekinokokkozis (KE), dünya çapında insan ve hayvanlarda yaygın olarak rastlanan ihmal edilmiş bir halk sağlığı ve ekonomik sorundur. Bu çalışmanın amacı, E. granulosus s.s. (G1/G3) izolatları içerisinde G1 ve G3 genotiplerinin PZR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PZR-RFLP) ve takiben Single Stranded Conformation Polymorphism (SSCP) teknikleriyle ayrımının yapılmasıdır. Çalışmada kullanılan insan, sığır ve koyun hidatik kist izolatlarına ait genomik DNA (gDNA)’lar E. granulosus s.s. (G1/G3) olduğu DNA dizi analizi ile teyit edilen örnekler arasından seçilmiştir. Genomik DNA’lar, E. granulosus s.s.’nun G1 ve G3 genotiplerini ayırt eden mt-nad5 bölgesini çoğaltan primerler kullanılarak PZR ile çoğaltıldı. Bu PZR ürünleri MboII, HindII ve HphI restriksiyon enzimleriyle ayrı ayrı kesildi. Daha sonra hazırlanan SSCP jeline bu kesim ürünleri yüklendi ve elektroforeze tabi tutulup jel gümüş nitrat ile boyanarak bantlar görünür hale getirildi. Bu çalışmada hepsi Elazığ ilinden elde edilen ikisi insan, altısı sığır ve 13’ü koyun olmak üzere toplam 21 izolat analiz edildi. Bütün örneklerde E. granulosus s.s.’un 759 bp’lik mt-nad5 gen bölgesi PZR ile başarılı bir şekilde çoğaltıldı. RFLP neticesinde MboII enzimi G1 ve G3 genotiplerine ait PZR ürünlerini dört farklı pozisyondan, HindII iki farklı ve yine HphI de iki farklı pozisyondan kesti. Takiben yapılan SSCP analizinde bütün örneklerin aynı bant profilini göstermesi nedeniyle E. granulosus s.s.’nun G1 ve G3 genotiplerinin bu yöntemle ayırt edilemeyeceği anlaşıldı.