MAYAYA ENTEGRE EDİLMİŞ MİKOTOKSİN AFB1 VE OTA(AFLATOKSİN VE OKRATOKSİN) BİYODEGRADASYON YOLAKLARININ GELİŞTİRİLMESİ

Abstract

Tüm dünyada hem ekonomik kayıplara hem de sağlık sorunlarına neden olan mikotoksinlerin etkin bir biçimde uzaklaştırılması, günümüzde çözüm bekleyen en önemli sorunlardan biri haline gelmiştir. Özellikle Aflatoksin B? (AFB?) ve Okratoksin A (OTA), gıda ve yem zincirinde en sık karşılaşılan, kanserojen, mutajenik ve nefrotoksik etkileriyle öne çıkan sekonder metabolitlerdir. Bu mikotoksinlerin giderilmesinde kullanılan fiziksel ve kimyasal yöntemler; yüksek maliyet, düşük etkinlik, uygulanabilirlik ve toksik kalıntı riski gibi açılardan çeşitli sınırlandırmalar taşımaktadır. Bu tez çalışması kapsamında enzimatik degradasyon yaklaşımı kullanılarak; her iki mikotoksinin degradasyonunu sağlayan, genetik olarak stabilize edilmiş çoklu enzim ekspresyon sistemine sahip rekombinant bir maya platformu geliştirilmesi amaçlanmıştır. Tez çalışması kapsamında, manganez peroksidaz (PhcMnp), amidohidrolaz (ADH3), zearalenon hidrolaz (ZHD101.1) ve AHL-laktonaz (Aiia) genleri seçilmiştir. Bu genler, Saccharomyces cerevisiae IMX581 genomuna CRISPR/Cas9 aracılı homolog rekombinasyon yöntemiyle, yüksek stabilite sağlayan kromozomların XI-5 ve X-2 bölgelerine entegre edilmiştir. Genetik entegrasyonun doğrulaması PCR amplifikasyonları ve Sanger dizileme analizleri ile gerçekleştirilmiştir. HPLC analizleri sonucunda, rekombinant maya suşlarının mikotoksin degradasyon verimleri; AFB? %99 ve OTA %97 degradasyon oranı elde edilmiştir. Degradasyon sürecinde meydana gelen kimyasal dönüşümler ise; FT-IR ve NMR spektroskopik analizleri ile değerlendirilmiştir. Elde edilen bu bulgular, toksinlerin yapısal olarak parçalanarak toksisite özelliklerini yitirdiğini göstermektedir. Sonuç olarak, bu çalışma AFB? ve OTA'nın eşzamanlı biyodegradasyonunu gerçekleştiren çok genli rekombinant maya suşunun ilk örneklerinden birini sunmaktadır. Bu sonuçlar, genetik stabilitesi, GRAS temelli güvenliği ve çoklu toksinlere karşı etkinliği sayesinde, gelecekte mikotoksin yönetiminde kullanılabilecek yeni nesil maya platformlarının geliştirilmesine önemli bir temel oluşturacaktır.The effective removal of mycotoxins, which cause both economic losses and health problems all over the world, has become one of the most important problems waiting to be solved today. Aflatoxin B? (AFB?) and Ochratoxin A (OTA), in particular, are the most frequently encountered secondary metabolites in the food and feed chain, with prominent carcinogenic, mutagenic and nephrotoxic effects. Physical and chemical methods used to remove these mycotoxins have various limitations such as high cost, low effectiveness, applicability and risk of toxic residue. In this thesis, it was aimed to develop a recombinant yeast platform with a genetically stabilized multi enzyme expression system that enables the degradation of both mycotoxins using the enzymatic degradation approach. Within the scope of the thesis study, manganese peroxidase (PhcMnp), amidohydrolase (ADH3), zearalenone hydrolase (ZHD101.1) and AHL-lactonase (Aiia) genes were selected. These genes were integrated into the Saccharomyces cerevisiae IMX581 genome by CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination into the XI-5 and X-2 regions of chromosomes, providing high stability. Confirmation of genetic integration was performed by PCR amplifications and Sanger sequencing analyses. As a result of HPLC analysis, mycotoxin degradation efficiencies of recombinant yeast strains were obtained as 99% AFB? and 97% OTA degradation rate. The chemical transformations that occur during the degradation process were evaluated using FT-IR and NMR spectroscopic analyses. These findings indicate that the toxins are structurally degraded and lose their toxicity. In conclusion, this study provides one of the first examples of a multigenic recombinant yeast strain that performs simultaneous biodegradation of AFB? and OTA. These results will provide an important basis for the development of next-generation yeast platforms that can be used in mycotoxin management in the future, thanks to their genetic stability, GRAS based safety and activity against multiple toxins.