ECHİNOCOCCUS GRANULOSUS'UN SIĞIR VE KOYUN İZOLATLARININ MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU, HAPLOTİP ANALİZİ VE MİRNA EKSPRESYON DÜZEYLERİNİN BELİRLENMESİ

Abstract

Kistik Ekinokokkozis (KE), Echinococcus granulosus'un larval formu tarafından oluşturulan, insanlarda ve ara konak hayvanlarda dünya çapında yaygın olarak görülen zoonotik bir helmint hastalığıdır. E. granulosus'taki genetik farklılıkların tespit edilmesi, hastalığın patojenitesi, bulaş yolu ve mücadele yöntemlerinin belirlenmesi bakımından önemlidir. E. granulosus'un konak ve parazit ilişkisindeki mekanizmaları açıklamaya çalışan yaklaşımlardan biri mikroRNA'lardır. Bu çalışmada sığır ve koyun orjinli hidatik kist izolatlarında E. granulosus s.l. genotip ve haplotip grupları belirlenerek, farklı kist yapılarında ve gruplar arasında, egr-miR-7, egr-miR-71 ve egr-miR-96 miRNA'larının ekspresyon seviyeleri karşılaştırılmıştır. Hedef miRNA'ların hastalığın tanısında biyobelirteç olarak kullanılabilme potansiyeli araştırılmıştır. Toplam 82 hidatik kist izolatından (41 sığır, 41 koyun) 81'inin genotipi, mt-CO1 gen bölgesine yönelik PCR ve sekans analizleriyle E. granulosus s.s. (G1 ve G3) olarak belirlenirken, sığır orjinli bir izolatın genotipi Echinococcus canadensis (G6/7) olarak tespit edilmiştir. Örneklerde toplam 26 nükleotid polimorfizmi ve 29 haplotip grubu belirlenmiştir. Steril kistlerde germinal membranlarda, fertil kistlerin germinal membran ve protoskolekslerinde miRNA ekspresyonları qRT-PCR ve Real Time PCR analizleri ile araştırılmıştır. E. canadensis (G6/7) örneği kontrol olarak seçilerek tüm haplotip gruplarındaki miRNA ekspresyon düzeyleri karşılaştırılmıştır. miRNA'ların 29 haplotip grubunun %79.31'inde yüksek, %10.345'inde düşük düzeyde eksprese olduğu belirlenmiştir. Koyun orjinli fertil 10 örnekte, protoskoleks yapısına kıyasla germinal membranda ortalamada egr-miR-7, egr-miR-71 ve egr-miR-96 miRNA'larının sırasıyla 44, 168 ve 351 kat yüksek düzeyde ekspresyon gösterdiği belirlenmiştir. Genotip ve haplotip grupları arasında yüksek oranda istatistiki olarak anlamlı olan ekspresyon düzeyi farklılıkları tespit edilmiştir. Sonuç olarak, egr-miR-7, egr-miR-71 ve egr-miR-96 miRNA'larının ve özellikle egr-miR-96'nın aktif KE teşhisinde biyobelirteç olarak kullanılabilme potansiyelinin olabileceği gösterilmiştir.Cystic Echinococcosis (CE) is a zoonotic helminth disease caused by the larval form of Echinococcus granulosus, which is common in humans and intermediate host animals worldwide. Detection of genetic differences in E. granulosus is important in terms of determining the pathogenicity of the disease, transmission route and control methods. One of the approaches trying to explain the mechanisms in the host-parasite relationship of E. granulosus is microRNAs. In this project, E. granulosus s.l. genotype and haplotype groups were determined in hydatid cyst isolates of cattle and sheep origin, and the expression levels of egr-miR-7, egr-miR-71 and egr-miR-96 miRNAs were compared in different cyst structures and between groups. The potential of target miRNAs to be used as a biomarker in the diagnosis of the disease was investigated. Genotypes of 81 out of 82 hydatid cyst isolates (41 cattle, 41 sheep) were determined by PCR and sequence analyzes for the mt-CO1 gene region of E. granulosus s.s. (G1 and G3), the genotype of an isolate of cattle origin was Echinococcus canadensis (G6/7). A total of 26 nucleotide polymorphisms and 29 haplotype groups were identified in the samples. miRNA expressions in germinal membranes of sterile cysts and germinal membrane and protoscoleces of fertile cysts were investigated by qRT-PCR and Real Time PCR analyses. E. canadensis (G6/7) sample was selected as control and miRNA expression levels in all haplotype groups were compared. It was determined that miRNAs were expressed at high levels in 79.31% of 29 haplotype groups and at low levels in 10.345%. In 10 fertile samples of sheep origin, egr-miR-7, egr-miR-71 and egr-miR-96 miRNAs were found to be 44, 168, and 351-fold higher in expression, respectively, in the germinal membrane compared to the protoscolex structure. High statistically significant differences in expression levels were detected between genotype and haplotype groups. In conclusion, it has been shown that egr-miR-7, egr-miR-71 and egr-miR-96 miRNAs, and especially egr-miR-96, may have the potential to be used as biomarkers in the diagnosis of active CE.