REKOMBİNANT MİKROORGANİZMALAR KULLANILARAK L-DOPA VE DOPAMİN'İN EŞZAMANLI BİYOSENTEZİ

Abstract

Çalışmada, Citrobacter freundii (NRRL B-2643) ve Erwinia herbicola (NRRL B-3466) gibi gram-negatif bakterilerin doğal (yabanıl) suşları ile Vitrocella hemoglobin (VHb+/VHb-) geni (vgb+/vgb-)'nin aktarılması sonucu elde edilen rekombinant suşları (Citrobacter freundii pMK57, Citrobacter freundii pMK79, Erwinia herbicola pUC8, Erwinia herbicola pUC8:15) kullanılmıştır. Doğal ve rekombinant suşlar ile hücre içi ve hücre dışı L-DOPA ve Dopamin'in biyosentezi sentetik fermantasyon ortamlarında karşılaştırmalı olarak çalışılmıştır. Araştırmada L-DOPA ve Dopamin üretim miktarının, hem genetik mühendisliği uygulaması olan rekombinant DNA teknolojisi ile hem de metabolit mühendislik uygulamalarından olan ortam optimizasyonu ile artırılması amaçlanmıştır. Deneyler, 250 ml'lik erlenlerde ve 1 litre hacmindeki biyoreaktörde gerçekleştirilmiştir. Çalışmada, karbon kaynağı (glikoz) derişimi, organik (pepton, yeast ekstrakt, üre) ve inorganik ((NH4)2SO4, NaNO3) azot kaynakları ve derişimleri ile diğer ortam bileşenleri (NaCl ve CaCl2)'nin yanı sıra, inokulum oranı, pH, sıcaklık ve çalkalama hızının L-DOPA ve Dopamin üretimi üzerine etkisi sentetik ortamlarda kesikli sistemde incelenmiştir. En yüksek L-DOPA ve Dopamin üretimi Citrobacter freundii MK79 rekombinant suşu kullanılarak sırasıyla hücre dışı 663 mg L-1 ve 481 mg L-1, hücre içi ise 339 mg L-1 ve 190 mg L-1 düzeylerinde optimize edilen fermantasyon ortamında (5.0 g L-1 glikoz, 15.0 g L-1 pepton, 12.5 g L-1 yeast extract, 2.5 g L-1 amonyum sülfat, 1.0 g L-1 kalsiyum klorür, pHb: 7.0, İnokulum oranı: % 5.0 v/v; Ortam sıcaklığı: 30 oC ve çalkalama hızı 200 rpm) elde edilmiştir. Kesikli olarak işletilen biyoreaktördeki fermantasyon ortamında kütle aktarım parametreleri araştırılmıştır. Karıştırma ve hava giriş hızı arttıkça hacimsel kütle transfer katsayısı, kLa ve oksijen tüketim hızı, ro değerinin de arttığı görülmüştür. Kesikli olarak işletilen bioreaktör sistemde, Citrobacter freundii (NRRL B-2643)'den L-DOPA biyosentezi kinetiği incelenmiştir. Çalışmada literatürde mevcut çeşitli kinetik modeller ile Yapay Sinir Ağı (YSA) ile oluşturulan model kıyaslanmıştır. Kinetik parametrelerin değerleri Genetik Algoritma Toolbox'ı ile optimizasyon yapılarak belirlenmiştir. Mikrobiyal büyüme, L-DOPA üretimi ve glikoz tüketimine ait deneysel sonuçlar ile modellerden elde edilen sonuçlar kıyaslanmış ve YSA modelinin sistemin davranışını daha iyi tanımladığı belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: L-DOPA, Dopamin, Citrobacter freundii (NRRL B-2643) Citrobacter freundii pMK57, Citrobacter freundii pMK79, Erwinia herbicola (NRRL B-3466), Erwinia herbicola pUC8, Erwinia herbicola pUC8:15, Rekombinant DNA teknolojisi, Daldırmalı fermantasyon, Biyoproses şartları, Kesikli fermantasyon, Biyoreaktör işletim parametreleri, Kinetik model, Genetik algoritma, Yapay sinir ağı.In the study, gram-negative bacterium as Citrobacter freundii (NRRL B-2643), Erwinia herbicola (NRRL B-3466) and their recombinant culture include (vgb+/vgb-) gene (Citrobacter freundii pMK57, Citrobacter freundii pMK79, Erwinia herbicola pUC8, Erwinia herbicola pUC8:15) were used. The biosynthesis of extracellular and cytoplasmic L-DOPA and Dopamine in synthetic fermentation media by wild and recombinant cultures as comparative studied. The research focused on the improvement of L-DOPA and Dopamine level using both of recombinant DNA technology and metabolic engineering application. Experiments were carried out in 250 ml shake-flask as well as 1.0 L bioreactor. In the study, the effect of carbon source (glucose), organic (peptone, yeast extract, urea) and inorganic ((NH4)2SO4, NaNO3) nitrogen sources and their concentrations, and other medium components (NaCl and CaCl2), inoculum, pH of initial media, temperature and shaking speed on production L-DOPA and Dopamine were investigated in synthetic media for microorganisms. Mass transfer characteristics of fermentation broth in batch bioreactor were investigated. Increases in both the agitation rate and the air feed rate increased volumetric mass transfer coefficients, kLa and oxygen uptake rates, ro values. The fermentation kinetics of L-DOPA by Citrobacter freundii (NRRL B-2643) were studied in a batch system. This study focuses on comparing different kinetic models in literature and the use of artificial neural networks model. Various kinetic parameters were obtained for L-DOPA fermentation optimising with Genetic Algorithm Toolbox. The experimental results of growth, L-DOPA production and glucose consumption are compared model results, and artificial neural networks model appeared to provide a reasonable description. Key Words: L-DOPA, Dopamine, Citrobacter freundii (NRRL B-2643), Citrobacter freundii pMK57, Citrobacter freundii pMK79, Erwinia herbicola (NRRL B-3466), Erwinia herbicola pUC8, Erwinia herbicola pUC8:15, Recombinant DNA technology, Submerged fermentation, Bioprocess conditions, Batch fermentation, Bioreactor operating parameters, Kinetic modeling, Genetic algorithm, Artificial neural network modeling.