METABOLİK MÜHENDİSLİĞİ YAKLAŞIMIYLA ZEAKSANTİN ÜRETİMİ

Abstract

Zeaksantin besleyici takviyeler, farmasötik, gıda renklendiricileri ve hayvan yemi katkı maddesi olarak kullanımı gittikçe önem kazanan karotenoid molekülüdür. Bu tez çalışmasında zeaksantinin Escherichia coli bakterisinde metabolik mühendisliği yaklaşımı ile heterolog üretimi amaçlanmıştır. Zeaksantinin E. coli'de heterolog üretimi için Gibson Assembly metodu kullanılarak zeaksantin sentezini gerçekleştiren enzimlerin anlatımını sağlayan genleri (crtEBIYZ) içeren plazmidin (pAC-EHER-EBIidiYZ) inşası gerçekleştirilmiştir. İnşa edilen plazmid farklı E. coli suşlarına (E. coli MG1655, E. coli NEB 10-beta, E. coli DH5?, E. coli DH5?-Pro, E. coli NEB-Turbo, E. coli XL1-Blue, E. coli TOP10, E. coli EPI300, E. coli DE3) aktarılmıştır ve plazmid aktarılan bu suşların sıvı kültürleri hazırlanmıştır. Hazırlanan sıvı kültürlerden zamana bağlı zeaksantin üretimi zamana bağlı zeaksantin ekstraksiyonu ve ekstraksiyon ürünlerinin Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile analizi yapılarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, pAC-EHER-EBIidiYZ plazmidinin aktarıldığı E. coli suşları arasında 72 saatlik inkübasyon süresinde HPLC analizleri yapılmıştır ve en yüksek zeaksantin üretimi E. coli MG1655 suşunda 2,786±0,145 mg/l, E. coli NEB 10-beta suşunda 2,757±0,102 mg/l, E. coli DH5? suşunda 2,669±0,104 mg/l olarak 24. saatte bulunmuştur. Anahtar kelimeler: Zeaksantin, Escherichia coli, Heterolog Üretim, Metabolik Mühendisliği

Zeaxanthin is a carotenoid molecule which, with time, gained particular importance in pharmaceutical industries, as well as in food industries as food supplement, colorant and animal food additive. The aim of this thesis was to make heterologous expression of zeaxanthin in Escherichia coli by using metabolic engineering principles. In order to ensure the heterologous zeaxanthin production in E. coli, the plasmid (pAC-EHER-EBIidiYZ) carrying the genes (crtEBIYZ) which are responsible for expression of enzymes involved in zeaxanthin biosynthesis, was assembled using the Gibson Assembly Method. This newly constructed plasmid was transformed into different E. coli strains (E. coli MG1655, E. coli NEB 10-beta, E. coli DH5?, E. coli DH5?-Pro, E. coli NEB-Turbo, E. coli XL1-Blue, E. coli TOP10, E. coli EPI300, E. coli DE3) and their liquid cultures were prepared. From bacterial cultures which were prepared in the above manner, time-related zeaxanthin production was measured by zeaxanthin extraction and analyzing the extraction products with the HPLC (High Pressure Liquid Chromotography). In this study, zeaxanthin analyses was done by HPLC in E. coli strains which were transformed with pAC-EHER-EBIidiYZ plasmid during 72 hours incubation and at the 24th hour the highest zeaxanthin production was found as 2,786±0,145 mg/l for E. coli MG1655 strain, 2,757±0,102 mg/l for E. coli NEB 10-beta strain, 2,669±0,104 mg/l for E. coli DH5? strain. Key words: Zeaxanthin, Escherichia coli, Heterolog Production, Metabolic Engineering