In vitro transkripsiyonla Fasciola hepatica Cathepsin L1 RNA'sının elde edilmesi (Ön çalışma)

Abstract

Bu çalışmada in vitro translasyonla cathepsin L1 proteini elde edilmesine temel oluşturmak için, F. hepatica cathepsin L1 geninin T7 promotor bölgesi bulunan bir plazmide klonlanması ve in vitro transkripsiyonla cathepsin L1 RNA'sının elde edilmesi amaçlanmıştır. Yetişkin F. hepatica, doğal olarak infekte sığır karaciğerinin safra yollarından elde edildi. Tersine transkripsiyon (TT) ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR)'de kullanılan primerler (FhP1 ve FhP2) Genbank EMBL L33771'den yararlanılarak dizayn edildi. M-MLV RT enzimi kullanılarak TT ile elde edilen cDNA, PZR ile çoğaltıldı. 981 baz çifti (bp) büyüklüğündeki PZR ürünü pCI-neo Mammalian Expression vektörüne yerleştirildi. Vektör kompetan E. coli JM 109 hücrelerine transforme edildi. İn vitro transkripsiyon işlemi Riboprobe in vitro Transcription Systems ile yapıldı. F. hepatica toplanı RNA'sından TT ile elde edilen 981 bazlık F. hepatica'nın cathepsin L1 cDNA'sı, rekombinant plazmid ve in vitro transkripsiyon işlemi ile DNA'dan elde edilen RNA etidyum bronıidle boyanmış agaroz jelde gösterildi. Sonuç olarak, bu çalışmada in vitro transkripsiyonla elde edilen RNA, cathepsin L1 RNA'sı, cathepsin L1 gen regülasyonu ve translasyon mekanizması üzerinde gelecekte yapılacak olan çalışmalarımıza temel oluşturması açısından önem arz etmektedir.