VALPROİK ASİT, ZİKONOTİD VE SPİNORFİNİN SIÇAN DORSAL KÖK GANGLİYON SİNİR HÜCRE KÜLTÜRLERİNE ETKİLERİNİN MOLEKÜLER VE ELKTROFİZYOLOJİK OLARAK İNCELENMESİ

Abstract

Bu çalısmanın amacı sıçan dorsal kök gangliyon (DKG) sinir hücrelerindevalproik asit, zikonotid ve spinorfinin etkilerini flüoresan kalsiyum görüntülemeyöntemleri ile belirlemektir. Valproik asitin etkileri patch kenetleme yöntemi ile deirdelenmistir. Dorsal kök gangliyonları diseke edildi ve enzimatik ve fizikselislemlerle izole tek hücrelere ayrıstırılarak %5 CO2 içeren inkübatörde 37 oC'detutuldu. Tüm hücre diyaliz patch kenetleme tekniginin akım kenetleme formu ile buhücrelerden aksiyon potansiyelleri kaydedildi. Fluoresan kalsiyum görüntülemedeneyleri için, önceden yüzeyi kaplanmıs lamellere ekilen DKG hücreleri kalsiyumaduyarlı boya olan Fura-2 AM (1 ?M) ile yüklendi. Ters mikroskopa (40X, 1,3 NAobjektif) baglantılı CCD kamera ve yazılım programından olusan kalsiyumgörüntüleme sistemi kullanılarak her bir DKG sinir hücresinde hücre içi serbestkalsiyum düzeyi ([Ca2+]i) 340/380 nm oranındaki degisikliklerden yararlanılarakbelirlendi. Veriler eslestirilmemis t testi ile analiz edildi ve P <.05 anlamlı kabuledildi. Patch kenetleme deneyleri sadece valproik asit için yapıldı ve valproik asituygulaması (30 ?M, 100 ?M ve 300 ?M) aksiyon potansiyeli parametreleri üzerineanlamlı bir etki etmedi (n=16). lave olarak valproik asit (100 ?M, n=10; 300?M,n=22 ve 1 mM, n=56) kalsiyum görüntüleme deneylerinde de yüksek K+ (KCl, 30mM) ile indüklenen [Ca2+]i cevaplarında bir degisiklik meydana getirmedi. Kalsiyumgörüntüleme deneylerinde zikonotid (1nM, n=12; 10 nM, n=18 ve 1?M, n=14) KClile olusturulan [Ca2+]i artıslarını doz bagımlı ve güçlü bir sekilde inhibe etti. Yineaynı sekilde spinorfin de doz bagımlı olarak ama daha çok küçük çaplı DKG nöronalt tiplerinde (10?M, n= 22; 100 ?M, n= 25 ve 300 ?M, n=35) yüksek K+ ileindüklenen [Ca2+]i cevaplarını inhibe etti. lave olarak, spinorfin ile ön muameleuygulanması sonrasında küçük çaplı nosiseptif özellikteki DKG hücreleri yüksek K+ile depolarizasyona cevapsızlık ortaya çıkarken, büyük çaplı non-nosiseptifhücrelerde yüksek K+ ile indüklenen yüzde [Ca2+]i cevapları etkilenmedi.Bu çalısmanın bulguları zikonotid ve spinorfinin, hücre zarı uyarılabilirligi venörotransmitter salıverilmesinde anahtar rol oynayan kalsiyum sinyallesmesini vehücre içi serbest kalsiyumdaki degisiklikleri inhibe ettigini ve etkin analjezik olmapotansiyeli arz ettiklerini ama valproik asidin bu baglamda etkisiz oldugunugöstermektedir. Spinorfin ve zikonotidin bu duyusal hücrelerde hücre içi kalsiyumsinyallerine etkileri ilk defa bu tez çalısması ile ortaya konmustur.Anahtar kelimeler: Aksiyon potansiyeli, valproik asit, zikonotid, spinorfin,hücre kültürü, patch kenetleme, iyon kanalları.

The aim of this study was to investigate the effects of valproic acid,ziconotide and spinorphin on cultured rat dorsal root ganglion (DRG) neurones usingfluorescence calcium imaging. The effects of valproic acid was also investigated bypatch clamp trechnique. Dorsal root ganglia were dissected out and isolated as singlecells by enzymatic and physical procedures and placed in humidifıed incubatorcontaining 5% CO2 at 37 °C. Action potentials were recorded from these cells usingthe whole celi current clamp mode of the patch clamp technique. For thefluorescence calcium imaging studies, the DRG neurons were cultured on coatedcoverslips and loaded with 1 umol Fura-2 AM. Free intracellular Ca2+ ([Ca2+];)responses were quantifıed by the changes in 340/380 ratio for individual DRGneurons using fluorescence imaging system consisting of CCD camera coupled to aninverted microscope (with a 40x, 1.30 NA objective) and software. Ali data wereanalyzed by using unpaired t test, P <05 defıning statistical signifıcance.Patch clamp experiments were performed only for valproic acid andapplication of valproic acid (30 uM, 100 uM and 300 uM) action potentialparameters (n=16). Furthermore, in fluorescence calcium imaging experimentsvalproic acid (100 uM, n=10; 300uM, n=22 ve 1 mM, n=56) did not have anysignifıcant effect on [Ca2+]; responses to membrane depolarisation by HK+ (KC1, 30mM). Again in calcium imaging experiments, ziconotide (nM, n=12; 10 nM, n=18ve luM, n=14) strongly inhibited the [Ca2+]; increase due to application of HK+ in adose dependent manner. Additionally spinorphin (lOuM, n= 22; 100 uM, n= 25 ve300 uM, n=35) inhibited the Ca2+ transients evoked with HK+ in concentrationdependant manner in a subpopulation of small-sized sensory neurons. Furthermore,after application of spinorphin a signifıcant percent of small-diameter nociceptiveDRG neurones did not respond to stimulation by HK+ while the percentage of theresponse was not signifıcantly changed in large-diameter non-nociceptive DRGneurones. Results from this study indicates that spinorphin and ziconotide but notvalproic acid significantly inhibits calcium signalling, transient changes in freeintracellular Ca2+ concentration which are key for the modulation of celi membraneexcitability and neurotransmitter release, these agents may be effective analgesics.The effects of spinorphin and ziconotide on intracellular calcium signalling in thissensory neurones is established for the fırst time by this thesis study.Key words: Action potential, valproic acid, ziconotide, spinorphin, celiculture, patch clamp, ion channels.