TAENİA MULTİCEPS HSP70 GENİNİN KLONLANMASI, EKSPRESYONU, REKOMBİNANT PROTEİNİN KARAKTERİZASYONU VE TEST KİTİ ÖZELLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI

Abstract

Taenia multiceps, erişkin formu köpek ve diğer etçillerin ince bağırsaklarında yaşayan taeniid bir sestoddur. Larvası, Coenurus cerebralis olarak bilinir ve koyun ve diğer ruminantların beyin ve medulla spinalisleri de içine alan sinir siteminde yerleşmektedir. Kistin varlığı tipik nörolojik semptomlara sebep olur ve vakaların çoğu hayvanların ölümüyle sonuçlanır. Coenurosis, yaygın olarak genç hayvanları etkilemesinden dolayı koyun çiftliklerinde önemli ekonomik kayıplara neden olabilir. Bu tezin amacı, koyunlarda T. multiceps HSP70 geni tarafından eksprese edilen proteinin koyun coenurosisi'nin tanısındaki etkinliğini belirlemek ve saha şartlarında uygulanabilir bir kit geliştirmekti. Bu amaçla, T. multiceps'in tüm genom sekansından HSP70'i kodlayan geni çoğaltacak primerler dizayn edilerek, enfekte bir koyunun beyninden elde edilen Coenurus cerebralis kistinden mRNA izolasyonu yapılıp takiben cDNA elde edildi. Dizayn edilen primerlerle ilgili gen bölgesi PZR ile çoğaltılıp, elde edilen ürün klonlanıp eksprese edildi. Daha sonra pürifiye edilen rekombinant proteinin etkinliği, bilinen pozitif ve negatif koyun serumları kullanılarak Western blot ile gösterildi. Ayrıca sahadan toplanan 1207 koyundan alınan serumlar ile rekombinant proteinin ELISA'daki etkinliği belirlendi. Bu işlemler neticesinde rekombinant TmHSP70 antijeninin western blot testindeki sensitivite ve spesifite değerleri %100 iken ELISA testinin sensitivite ve spesifite oranları sırasıyla %66,6 ve %52,6 olarak belirlenmiştir. Aynı zamanda bakısı yapılan 1207 serum örneğinin 567 (%46,97)'si ELISA ile pozitif olarak bulunmuştur. Sonuç olarak rekombinant TmHSP70 antijeninin koyunlarda coenurosisin tanısında western blot temelli bir testte kullanılabileceği gösterilmiştir.Taenia multiceps is a taeniid cestode that lives in the small intestine of adult canines and other carnivores. Its larva is known as Coenurus cerebralis and is located in the nervous system of sheep and other ruminants, including the brain and medulla spinalis. The presence of the cyst causes typical neurological symptoms and most cases result in the death of the animals. Coenurosis can cause significant economic losses to sheep farms as it commonly affects young animals. The aim of this thesis was to determine the efficacy of the recombinant protein expressed by T. multiceps HSP70 gene in the diagnosis of sheep coenurosis in sheep and to develop a kit applicable in field conditions. For this purpose, primers were designed to amplify the gene encoding HSP70 from the whole genome sequence of T. multiceps, mRNA was isolated from C. cerebralis cyst obtained from an infected sheep's brain and then cDNA was isolated. The gene region related to the designed primers was amplified by PCR and the product obtained was cloned and expressed. The efficiency of the recombinant protein purified afterwards was demonstrated by Western blot using known positive and negative sheep sera. In addition, the efficiency of the recombinant protein in ELISA was determined with sera collected from 1207 sheep. As a result of these procedures, the sensitivity and specificity values of the recombinant TmHSP70 antigen in the western blot test were 100%, while the sensitivity and specificity rates of the ELISA test were 66.6% and 52.6%, respectively. At the same time, 567 (46.97%) of the 1207 serum samples analyzed were found to be positive by ELISA. As a result, it has been shown that recombinant TmHSP70 antigen can be used in a western blot-based test for the diagnosis of coenurosis in sheep.