Tavuklardan İnfeksiyöz Bronşitis Virüsünün (IBV) İzolasyonu, Hızlı Moleküler Tanısı, S1 ve N Genlerinin Varyasyon ve Filogenetik Analizi ve Baculovirüs Sistemi ile Rekombinant S1 Proteininin Üretimi

Abstract

TÜBİTAK tarafından desteklenen bu projede (113O411), infeksiyöz bronşitis virüsü (IBV) ile ilgili saha çalışmaları, serolojik, virolojik, moleküler biyolojik ve rekombinant teknolojisi ile protein üretimi çalışmaları yapıldı. Projede canlı hayvanlardan alınan 1310 adet trakeal svab örnekleri ile yapılan çalışmalar neticesinde toplam 67 yumurtacı çiftlikten, 37 adedinde, 61 broyler çiftlikten 55 adedinde real-time RT-PCR ile IBV pozitifliği tespit edildi. Ayrıca 119 broyler ve 14 yumurtacı çiftlikten toplam 757 adet hayvandan alınan doku örneklerinin incelenmesi sonucunda 89 broyler ve 9 yumurtacı çiftlik real-time RT-PCR ile IBV yönünden pozitif bulundu. Pozitif bulunan hayvanlardan bazılarında, halsizlik, depresyon ve solunum sistemi belirtileri görüldü. Nekropsi uygulanan hayvanlarda trakeada hiperemi, seröz veya serömukoz eksudat saptandı. Bazı piliçlerin böbreklerinde ise solgunluk gözlendi. İsrail varyant- 2 saptanan aşısız civcivlerden bir tanesinin bezli midesinde hemorajiler gözlendi. Yapılan mikroskopik incelemelerde, trakeada mukoza epitelinde desiliasyon, mukoza ve submukozada ödem hiperemi ve/veya kanama, lenfosit ve/veya heterofil lökositlerden oluşan yapısal hücre infiltrasyonları saptandı. Hiperemi ve hücre infiltrasyonları akciğer ve böbreklerde de görüldü. Real time PCR ile CT değeri düşük olan hayvanlarda trakea ve akciğerdeki lezyonların derecesinin şiddetli olduğu gözlendi. Real time RT-PCR ile pozitif bulunan düşük CT değere sahip örneklerin sekans analizi verilerine göre, broylerlerden sekanslanan 2 örneğin dizilimleri ile IS/236 izolatı (%99,7), Ma5 suşu (%99,2- 99,7), China-W93 izolatı (%99-99,5), H120 suşu (%99-99,5), NGA/310/2006 suşu (%99,5-100), Mass41 suşu (%97,5-98,1), Connecticut vaccine suşu (%96,4-96,9) ve Florida 18288 suşu (%95,9-96,4) dizilimleri arasında benzerlik olduğu görüldü. Broylerlerden sekanslanan 9 örneğin dizilimleri ile Türkiye’den daha önce rapor edilen genlere benzer olarak İsrail varyant-2 suşlarının (AY091552, JX027069, EU780077, JX027070) dizilimleri ile %94,9-99,7 aralığında benzerlik gösterdiği görüldü. Yumurtacılardan sekanslanan 5 örneğin dizilimleri ile İran, Hindistan ve Çin’den bildirilen suşlar ve İsrail varyant-1’inde içinde yer aldığı 4/91 genetik grubunda %95.1 ile % 99.1 aralığında benzerlik olduğu tespit edildi. Yeni filogenetik gruplandırmaya (Valastro ve ark., 2016) bağlı olarak 2016 yılında saptanan örneklerle oluşturulan filogenetik ağaca göre ise örneklerden 6 tanesinin GI-1 grubunda bulunan Massachusetts (Mass, M41) suşuna benzer olduğu, 1 tanesinin GI-12 grubuna dahil D274 suşuna benzer olduğu, 2 tanesinin GI-13 grubunda bulunan 793/Varyant 1 suşuna benzerlik gösterdiği ve 33 tanesinin ise GI-23 grubuna dahil İsrail varyant 2 suşuna benzer olduğu görüldü. Baculovirüs ekspresyon sisteminde üretilen rekombinant IBV-S1 ve IBV-N proteinlerinin karakterizasyonu ve tavuk serumlarına karşı reaksiyonunu araştırmak amacıyla yapılan çalışmalarda her iki proteine karşı Anti-His (C-Terminal) monoklonal antikorlar ile reaksiyon saptandı ve N için 52-54 kDa ve S1 için 23 kDa civarında bantlar görüldü. Sahadan alınan aşısız infekte tavuk serumları ve S1 ve N protein ve inaktif virüsle ile immunize edilen civciv serumlarıyla her iki proteine karşı ELISA’da reaksiyon oluştu. Aynı serumlarla immunobloting yapıldığında sadece N protein ile 52-54 kDa civarında bant görüldü. Sonuç olarak, sahada sirküle olan IB virüslerinin saptanması amacıyla öncelikle real time RTPCR yapılması ve daha sonra birçok suşu saptayabilecek primerlerle S1 geni sekansı yapılarak genotiplerin belirlenmesinde yarar vardır. Filogenetik ağaç oluştururken yeni genogrupların dikkate alınması gerekmektedir. S1 geni sekans analizi verilerine göre Türkiye’de daha çok Israil varyant-2 suşu saptandı ve gelecekte bu suşun varyasyona veya rekombinasyona uğrayıp uğramadığı takip edilmelidir. Projede üretilen rekombinant IBV-N proteininin tanısal testlerden ELISA’da kullanılabileceği görüldü. Bu amaçla kit geliştirilmesi ve Patent alınmasında yarar vardır.