KOMBİNE KLOSTRİDİAL AŞI ÜRETİMİNDE KULLANILMAK ÜZERE C. PERFRİNGES BETA, EPSİLON VE C. NOVYİ ALFA TOKSİNLERİNİ ÜRETEN REKOMBİNANT SUŞ GELİŞTİRİLMESİ

Abstract

Enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitis, küçükbaş hayvanlarda yüksek ölüm oranları ve ciddi ekonomik kayıplara yol açan, Clostridium türlerinin neden olduğu önemli bakteriyel hastalıklardır. Enterotoksemi, genellikle C. perfringens tip C ve D suşlarının toksinleriyle, enfeksiyöz nekrotik hepatit ise C. novyi tip B'nin toksinleriyle ilişkilidir. Bu hastalıkların kontrolünde geleneksel olarak aşılar ve hijyen/beslenme önlemleri kullanılmaktadır. Ancak klasik aşıların üretiminde yaşanan zorluklar, toksinlerin bağışıklık sistemini yeterince uyaramaması gibi sorunlar, daha etkili ve güvenli aşı stratejilerine olan ihtiyacı artırmıştır. Bu nedenle, rekombinant DNA teknolojisi ve sentetik biyoloji gibi modern yaklaşımlar, tanımlı antijenlerle yüksek verimli ve ölçeklenebilir aşı üretimine olanak sağlamaktadır. Bu tez kapsamında, enterotoksemi ve enfeksiyöz nekrotik hepatitise karşı etkin bir aşı adayının geliştirilmesinde kullanılmak üzere rekombinant E. coli suşlarının tasarımı ve inşası gerçekleştirilmiştir. Hedef toksin genlerini taşıyan "pCpDetx, j23119-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpDetx, j23119-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, j23119-pelB-CnBtcn-alpha, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha" olmak üzere yedi farklı plazmid aracılı suş geliştirilmiştir. Bu plazmidler oluşturulurken ilave gen dizilerinin tasarıma eklenmesi ile daha yüksek seviyede protein ekspresyonu amaçlanmıştır. Ayrıca plazmidler, yüksek seviyede toksin üretimi sağlayabilecek konak sistemlerinde (ör. E. coli BL21 (DE3), C41 (DE3), C43 (DE3)) test edilmiştir ve E. coli C43 (DE3) suşu yüksek protein ekspresyonu gözlemlenmiştir. Ayrıca CpDetx ve CpCcpb toksin genlerin plazmid aracılı inşalarının yanı sıra, bu genler hem ayrı ayrı hem de ikili olarak genoma entegrasyonları da başarılı bir şekilde tamamlanmıştır. Bu doğrultuda "E. coli cpb+, E. coli etx+ ve E. coli etx+ cpb+ " olarak adlandırılan genoma entegre suşlar elde edilmiştir. Üretilen rekombinant toksin proteinlerinin ekspresyon düzeyleri SDS-PAGE ile analiz edilmiş, bant yoğunlukları karşılaştırılarak en uygun plazmid ve konak kombinasyonu belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre, pET tabanlı ekspresyon plazmidini taşıyan (pET-28 (a)-pelB-CpDetx, pET-28 (a)-pelB-CpCcpb, pET-28 (a)-pelB-CnBtcn-alpha) E. coli C43 (DE3) suşu, toksin genleri için yüksek düzeyde protein ekspresyonu sağlamıştır.Enterotoxemia and infectious necrotic hepatitis are important bacterial diseases caused by Clostridium species, causing high mortality rates and significant economic losses in small ruminants. Enterotoxemia is generally associated with toxins of C. perfringens type C and D strains, while infectious necrotic hepatitis is associated with toxins of C. novyi type B. Vaccines and hygiene/nutritional measures have traditionally been used to control these diseases. However, difficulties in the production of conventional vaccines, including the inability of toxins to sufficiently stimulate the immune system, have increased the need for more effective and safe vaccine strategies. Therefore, modern approaches such as recombinant DNA technology and synthetic biology enable high-throughput and scalable vaccine production with defined antigens. In this thesis, the design and construction of recombinant E. coli strains were conducted for use in the development of an effective vaccine candidate against enterotoxemia and infectious necrotic hepatitis. Seven different plasmid-mediated strains carrying the target toxin genes, namely "pCpDetx, j23119-pelB-CpDetx, pET-28(a)-pelB-CpDetx, j23119-pelB-CpCcpb, pET-28(a)-pelB-CpCcpb, j23119-pelB-CnBtcn-alpha, pET-28(a)-pelB-CnBtcn-alpha", were developed. While constructing these plasmids, higher levels of protein expression were aimed by incorporating additional gene sequences into the design. In addition, the plasmids were tested in host systems capable of high-level toxin production (e.g., E. coli BL21(DE3), C41(DE3), C43(DE3)), and high protein expression was observed in the E. coli C43(DE3) strain. In addition to the plasmid-mediated construction of the CpDetx and CpCcpb toxin genes, their integration into the genome, both individually and in pairs, was also successfully completed. In this way, genome-integrated strains designated "E. coli cpb+, E. coli etx+, and E. coli etx+ cpb+" were obtained. The expression levels of the produced recombinant toxin proteins were analyzed by SDS-PAGE, and the optimal plasmid and host combination was determined by comparing band intensities. According to the results, the E. coli C43 (DE3) strain carrying the pET-based expression plasmid (pET-28(a)-pelB-CpDetx, pET-28(a)-pelB-CpCcpb, pET-28(a)-pelB-CnBtcn-alpha) provided high levels of protein expression for the toxin genes.