SIĞIR VEBASI VİRÜSÜ MATRİKS GENİNİN KLONLANMASI VE ÖKARYOTİK HÜCRELERDE AÇIKLANMASI

Abstract

Bu çalışmanın amacı sığır vebası (SV) virüsü RBOK aşı suşu matriks (M) geninin klonlanması ve ökaryotik hücrelerde açıklatılmasıdır. Bu amaçla, SV RBOK aşı suşu ile infekte Vero hücrelerinden toplam RNA elde edildi. Matriks DNA amplikonları tersine transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (TT-PZR) ile oluşturuldu. Matriks genine özgü primerler kullanılarak 1038 bazlık M geni kodlama bölgesi çoğaltıldı. Daha sonra, matriks geni pTOPO XL klonlama vektöründe klonlandı. Matriks geninin varlığı PZR-tarama (PZR-T) ve enzim kesim deneyleriyle gösterildi. Elde edilen plasmid EcoRL ve Şali enzimleriyle kesilerek M geni pCI-neo açıklama vektörüne yerleştirildi. pCI-neo Matrix vektöründe M geninin varlığım teyit etmek amacıyla PZR-T ve enzim kesim deneyleri yapıldı. Oluşturulan rekombinant plazmid, pCI-neo Matrix vektörü olarak adlandırıldı. Sonrasında, rekombinant pCI-neo Matrix plazmidi Vero hücrelerine geçici olarak transfekte edildi. Matriks proteinin varlığı Vestern immunoblotlama ile gösterilerek Vero hücrelerinin anti-M antikoruyla reaksiyona giren 38 kDa'luk bir proteini açıkladığı gösterildi. Anahtar Kelimeler: Sığır vebası, matriks geni, klonlama, protein açıklanması.

The aim of this study was to cloning and in eucaryotic cells to expression of matrix (M) gene of RBOK vaccine strain of rinderpest virus (RPV). For this purpose, total RNA was extracted from Vero cells infected with RBOK vaccine strain of RPV. Matrix DNA amplicons were obtained with reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). 1038 bases matrix coding gene region was amplified by using spesific primers to the matrix gene. Then, the M gene was cloned into TOPO XL cloning vector. The presence of M gene was confirmed by PCR screening and enzyme digestion assays. The recombinant plasmid was cut with EcoRL and Sail enzymes to obtain the M gene. Then, the M gene was placed into pCI-neo mammalian expression vector. So, the resulting recombinant plasmid was named as pCI-neo Matrix. Afterwards, the pCI-neo Matrix vector was transiently tranfected into Vero cells. The presence of the Matrix proteins was showed by Western Immunoblotting assay demonstrating that Vero cells express a 38 kDa protein reacting with anti-M antibody. Key words: Rinderpest, matrix gene, cloning, protein expression.