THEİLERİA PARVA'NIN LAKTAT DEHİDROGENAZ ENZİMİNİ KODLAYAN GENİN İZOLASYONU, KLONLANMASI VE EKSPRESYONU

Abstract

Theileria parva, Şark sahili humması adı verilen (East Coast Fever, ECF), sığırlarda önemli ekonomik kayıplara neden olan kene kaynaklı bir hastalık etmenidir. ECF'nin tedavisinde kullanılan ilaçların maliyetlerinin yüksek olması, bu ilaçlardan bazılarına direnç geliştirildiğinin rapor edilmesi, parazite karşı etkili bir aşının bulunmaması hastalıkla mücadelede önemli bir problemdir. Bu nedenle etkili, ucuz ve güvenle kullanılabilecek yeni ilaçların geliştirilmesini sağlayacak, kemoterapötik hedeflerin araştırılması gerekmektedir.Theileria parva ihtiyaç duyduğu enerjiyi glikoliz ile sağlamaktadır. Glikoliz metabolizmasında önemli bir yere sahip olan enzimler, antiheileriallerin tasarımı için yeni hedef olabilirler. Laktat dehidrogenaz enzimi, parazitin glikoliz enzimleri arasında en yüksek aktiviteyi gösteren enzim olmasından dolayı terapötik hedef olarak seçilmiştir. Laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan genin klonlanması standart metodlarla gerçekleştirilip, pGEM-T vektörüne aktarılmıştır. TpLDH geni 2 intron ve 3 ekson içerip, intronlarıyla beraber toplam 1353 baz çiftinden oluşmuştur. TpLDH geninin intronları yönlendirilmiş mutagenezle çıkarılıp, ekson fragmentleri PCR ile birleştirilmiştir. PCR ile gerçekleştirilen çalışmanın sonunda, TpLDH geni intronsuz, 966 baz çifti uzunluğunda, ekspresyona hazır halde elde edilmiştir.Anahtar Kelimeler: Theileria parva, Apikompleksan, Laktat dehidrogenaz, Antitheilerial, Kemoterapötik HedefTheileria parva is the causative agent of East Coast fever (ECF), a tick born disease, result in major economic losses in cattle. The high costs of drugs used to treat of ECF, development of resistance to some of these drugs , the absence of an effective vaccine against the parasite are significant problems in dealing with this illness. Thus, it is necessary that exploiting new resources to identify effective therapeutic targets to help develop new, effective, and cheap drugs, is imperative.Glycolysis is the main pathway of Theileria parva for energy production. The enzymes that play an important role in glycolysis may provide new targets for designing antitheilerials. Given its highest activity among glycolytic enzymes of the parasite, lactate dehydrogenase enzyme has been selected as the therapeutic target. Lactate dehydrogenase gene was cloned into pGEM-T vector with standard methods. TpLDH gene contains 2 introns, 3 exons and the gene is 1353 base pair in lenght. The introns were removed by site-directed mutagenesis then, exons fragments were ligated by PCR which generated a protein coding region 966 bp in length.Key Words: Theileria parva, Apicomplexan, Lactate Dehydrogenase, Antiheilerial, Chemotherapeutic Target