ÜÇ GÜN HASTALIĞI VİRUSU TÜRKİYE İZOLATININ TÜM GENOM SEKANSLANMASI VE BU VİRUSA KARŞI DNA AŞISI GELİŞTİRİLMESİ

Abstract

Bovine ephemeral fever (BEF) yüksek verimli sığır ve mandalarda önemli kayıplara yol açabilen, kısa süreli klinik tablo ile karakterize arboviral bir hastalıktır. Bu tez çalışmasında öncelikle, Türkiye'de 2012 yılında ortaya çıkmış BEF salgınından izole edilen bovine ephemeral fever virüs (BEFV)'ün ileri düzeyde genetik karakterizasyonu amaçlanmıştır. Ayrıca mevcut tez çalışmasında, BEFV glikoprotein (G) ve BEFV nükleoprotein (N) gen bölgelerini içeren rekombinant vektörün oluşturulması ve rekombinant vektörlerle immunize edilen BALB/c farelerinde bu proteinlere karşı humoral immun cevabın uyarımı hedeflenmiştir. Genetik karakterizasyon amacıyla BEFV tam genomunu kapsayan 600-800 bç kısmi gen bölgeleri RT-PCR ile çoğaltılmıştır. ABI 310 Genetik analiz® sisteminde çift yönlü okutulan gen ürünleri ClustalW programı ile hizalanmış ve veriler gen bankasına sunulmuştur. Filogenetik analiz işlemi MEGA5 paket programı ile gerçekleştirilmiş farklı izolatlarla benzerlikleri yönünden kıyaslanmıştır. Sonuçlar, BEFV izolatları arasındaki filogenetik ilişkilerin coğrafi konumla yakından ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Ayrıca izolatlar arasında genetik rekombinasyon durumuna rastlanmamıştır. Rekombinant vektör oluşturulması ve immunizasyon çalışması amacıyla BEFV G ve BEFV N genleri pcDNA4/HisMax© TOPO® TA ekspresyon vektörüne aktarılarak TOP10 kompeten hücrelerinde çoğaltılmıştır. pcDNA4-G ve pcDNA4-N plazmidleri öncelikle Vero E6 hücrelerine transfekte edilerek, Vestern blot ve immunoperoksidaz testleri ile protein düzeyinde ve RT-PCR testi ile mRNA düzeyinde ekspresyonları gösterilmiştir. Uygun plazmidler lipofektamin 2000 ile muamele edilerek 0., 14., 21. günlerde BALB/c farelerine kas içi uygulanmıştır. İmmunize farelerdeki antikor yanıt plak redüksiyon nötralizasyon testi (PRNT) ve ELISA testleri ile ölçülmüştür. BEFV G ve N indirek ELISA sonuçlarına göre bu gruplardaki yedi hayvandan yalnızca ikisi cutoff düzeyini aşabilmiştir. pcDNA4-N ve pcDNA4-G immun gruba ait 450 nm absorbanstaki ortalama OD değeri plazmid kontrol grubu ile kıyaslandığında fark 30. günde istatistiki olarak anlamlı hale gelmiştir (p<0.001), (p<0.05). PRNT50 sonuçlarına göre pcDNA4-G (100 µg) ile immunize farelerde 30. günde 1:20 (p<0.05) düzeyinde antikor yanıt alınırken BEFV (1000 PFU/0.5ml) verilen farelerde ise bu oran 1:80'e (p<0.001) ulaşmıştır. Sonuç olarak rekombinant proteinlerin üretimi ve rekombinant vektörler ile immunize edilen deney farelerinde humoral yanıtın uyarımı noktasında başarı sağlanmıştır.Bovine ephemeral fever (BEF) is an arboviral disease characterized by a short-term clinical picture that can lead to significant loss in high-yielding cattle and water buffalo. In this dissertation study, briefly bovine ephemeral fever virus (BEFV) which is isolated from the BEF outbreak in 2012 in Turkey genetic characterization is aimed at the advanced level. Furthermore, it was aimed to generate a recombinant vector containing BEFV glycoprotein (G) and BEFV nucleoprotein (N) gene regions and to stimulate the humoral immune response against these proteins in BALB/c mice immunized with these vectors. BEFV was amplified by RT-PCR with partial gene regions of 600-800 bp including the complete genome for genetic characterization. The amplified RT-PCR products were sequenced using both directions with the forward and reverse primers in the ABI 310 Genetic Analysis® System. The Gene sequences were aligned using ClustalW program and presented to the gene bank. The phylogenetic analysis process was compared for similarity with the different isolates performed by the MEGA5 software program. The results show that phylogenetic relationships between BEFV isolates are closely related to the geographical location. There was also no genetic recombination between isolates. For recombinant vector design and immunization studies, BEFV G gene and BEFV N gene were transferred to the pcDNA4/HisMax© TOPO® vector and these recombinant vectors propagated in TOP10 competent cells. pcDNA4-G and pcDNA4-N recombinant plasmids were firstly transfected into Vero E6 cells and expressions were demonstrated at the protein level by Western blot and immunoperoxidase tests and demonstrated at the mRNA level by RT-PCR test. The suitable plasmids were treated with lipofectamine 2000 and intramuscularly administered to BALB/c mice at days 0, 14, 21. Antibody response in immunized mice was measured by plaque reduction neutralization test (PRNT) and ELISA. According to the BEFV G and N indirect ELISA, only two of the seven animals in these groups exceeded the cutoff value. When the mean OD values at 450 nm absorbance of the pcDNA4-N and the pcDNA4-G immunized mice group were compared with the plasmid control group, the difference became significant at 30 days (p<0.001), (p<0.05). According to PRNT50 results, 1:20 (p<0.05) antibody response was obtained at 30 days in pcDNA4-G (100 µg) immunized mice, whereas this ratio was 1:80 (p<0.001) in mice given BEFV (1000 PFU/0.5ml). As a result, recombinant proteins were successfully produced and stimulation of the humoral response was induced in experimental mice immunized with recombinant vectors.